专利名称：人血清白蛋白与尿酸氧化酶的融合蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白，尤其涉及一种人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合蛋白 及其制备方法。
背景技术：
嘌呤是生物体遗传物质核酸的重要组成部分，核酸代谢产生嘌呤核苷酸，后者 分解产物黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下产生尿酸，尿酸可进一步在尿酸氧化酶(Urate Oxidase,U0X)的作用下分解为尿囊素、尿囊酸、C02和NH3。人类和一些灵长类动物体内缺 乏有活性的尿酸氧化酶，因此尿酸是人类和这些动物嘌呤代谢的最终产物。尿酸溶解度较 低，经尿酸氧化酶的氧化后分解为溶解度更高的尿囊素，使核酸代谢产物更容易排出体外。 如果血液和尿液中尿酸浓度持续升高出现高尿酸血症，常导致疾病发生，其中比较有代表 性的是痛风。痛风是尿酸代谢紊乱引起的一种慢性疾病，尿酸盐结晶在关节和软组织沉积是其 发病原因，伴随着炎症，有些病人最后发展为关节受损或者骨关节病。随着生活水平的不断 提高，高尿酸血症和痛风发病率明显增高。流行病学的调查显示，国外至上世纪90年代，英 国痛风患者20年间增加了 3倍，1990至1999年间美国痛风患者增加80%，加拿大30岁 以上男性和50岁以上女性痛风发病率已达2%，80岁以上男性达9%。我国痛风发病率为 0. 3%，现有400多万痛风患者，每年有200多急性发作，近100万人痛风致残。积极控制高 尿酸血症和痛风危险因素是减少痛风发作的关键，也是降低心血管疾病危险的重要环节之一。 目前痛风治疗主要使用痛风炎症干扰药物和降尿酸化学药，代表性药物有秋水仙 碱、非留体抗炎药、肾上腺皮质激素、尿酸促排药、抑制尿酸生成药。秋水仙碱具有缓解痛风 炎症的特异性，通常是小剂量多次口服用药，但该药有严重的胃肠道反应。其它抗炎药也都 起到改善症状的作用，但副作用都很大。丙磺舒、苯磺唑酮、痛风利仙是常用的促尿酸排泄 药物，别嘌呤醇抑制尿酸的形成，这些药都需要服用较长时间来维持治疗效果，它们的副作 用发生率相同，而以别嘌呤醇最严重，常发生别嘌呤过敏综合症达10%，这些患者死亡率达 25%。新近开发的新型黄嘌呤氧化酶抑制剂Febuxostat作用强于别嘌呤醇，但需要常年用 药。有一部分痛风患者目前的治疗方法不起作用，这些难治性痛风患者经常发生急性关节 炎，慢性关节变形，出现尿酸盐引起的结节瘤，患者身体活动能力丧失。这些严重的痛风患 者尤其需要有效的治疗手段以缓解病情，提高生活质量。国外已开发了重组尿酸氧化酶产品(Rasburicase)，尿酸氧化酶能够特异性地将 尿酸分解为溶解度更高更容易排除体外的尿囊素。国外上市的重组尿酸氧化酶临床适应症 为用于预防和治疗儿童白血病、淋巴癌和恶性实体瘤治疗中可能发生的肿瘤溶解综合征 导致的高尿酸血症。该产品主要的副作用是发生免疫反应、产生抗体和过敏反应，其次是半 衰期短。对于痛风患者，无法长期用药。为了将尿酸氧化酶用于痛风患者，有必要采用蛋白 质缓释技术延长其半衰期，降低抗原性。
聚乙二醇(Polyethlene glycol, PEG)是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子 物质，可以通过共价键结合方式修饰蛋白质。蛋白质的聚乙二醇化修饰是克服蛋白质免 疫原性的-种有效方法，聚乙二醇修饰蛋白质药物不仅可以降低免疫原性和毒性、而且能 明显提高蛋白质药物的稳定性，减少蛋白质分子通过肾脏的排泄，延长体内半衰期。美国 Savient公司开发的聚乙二醇修饰尿酸氧化酶Pegloticase已于2008年8月完成三期临床 试验向美国FDA提交新药注册申请，试验结果表明该产品对痛风有明显的治疗作用，但是 88%病人会出现抗体，引起疗效的降低，5%病人有过敏反应。而且活化的聚乙二醇价格昂 贵，使得这类产品的价格很高。以人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)为载体的融合蛋白技术-白蛋白 融合技术(Albumin fusion technology)是另一倍受关注的延长蛋白质半衰期的方法。由 于HSA无酶活性和免疫原性，人体相容性好，分子量大(约为66kDa)，半衰期长约19d，微 ^.^RW^&mM [Chuang VT, Kragh-Hansen U, Otagifi M. Phammceutical strategies utilizingrecombinant human serum albumin [J] Pharm Res, 2002,19 (5) :569_577]等优 点，通过构建融合蛋白技术增加多肽/蛋白类药物分子量可延长药物半衰期。
发明内容
本发明的目的是提供一种半衰期长的尿酸氧化酶新型制剂，特别是人血清白蛋白 和尿酸氧化酶的融合蛋白。本发明的人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合蛋白由人血清白蛋白氨基酸序列、尿 酸氧化酶氨基酸序列和连接肽组成，融合蛋白序列由人血清白蛋白氨基酸序列、尿酸氧化 酶氨基酸序列通过连接肽连接。本发明的人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合蛋白的人血清白蛋白氨基酸序列和 尿酸氧化酶氨基酸序列可以是其突变体。本发明的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白，人血清白蛋白的氨基酸序列在融 合蛋白的N端，尿酸氧化酶氨基酸序列在融合蛋白的C端；或者，人血清白蛋白的氨基酸序 列在融合蛋白的C端，尿酸氧化酶氨基酸序列在融合蛋白的N端，两个蛋白质的氨基酸序列 通过连接肽连接。本发明人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白连接肽氨基酸序列为 [GlyGlyGlyGlySer]n，其中 n 为 1-10 的整数。优选的本发明人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白的连接肽氨基酸序列为 [GlyGlyGlyGlySer]n，其中 n 为 1-3 的整数。本发明人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白的尿酸氧化酶氨基酸序列是黄曲霉、 球形节杆菌或假丝酵母来源的真菌或微生物尿酸氧化酶及其突变体，或者，尿酸氧化酶氨 基酸序列是来源于哺乳动物尿酸氧化酶序列及其突变体；或者，尿酸氧化酶氨基酸序列是 来源于果蝇的无脊椎动物的尿酸氧化酶序列及其突变体；或者，尿酸氧化酶氨基酸序列是 来源于植物的重组尿酸氧化酶及其突变体，或者是这些序列不同片段的嵌合体。优选的本发明的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白，尿酸氧化酶为黄曲霉尿酸 氧化酶。本发明还提供为获得编码权利要求1-6任意一项权利要求所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白基因的引物DNA序列。本发明进一步提供含有权利要求7所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白DNA序列的工程菌株。本发明还提供一种制备人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白的方法克隆人血清 白蛋白和尿酸氧化酶基因，拼接获得人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白基因，构建重组 质粒，转化酵母宿主菌，筛选获得工程菌株，培养工程菌，诱导人血清白蛋白和尿酸氧化酶 融合蛋白的表达，分离纯化获得人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白。本发明构建的重组质粒转化毕赤酵母，培养获得的表达产物可以经各种生物工程 的下游技术方法进行分离纯化获得产品，其中包括超滤、盐析、沉淀、离心、透析、离子交换 层析、疏水层析、亲和层析、反相层析、分子筛层析技术中的一种或几种。
图1是重组质粒pPIC9-HSA-U0X构建示意图；
图2是表达产物的SDS-PAGE电泳分析。1 泳道标准蛋白质分子量(97. 4,66. 2、43、31、20、14. 4kd)；2 4 泳道纯化 HAS-UOX。
具体实施例实施例1 :HSA cDNA的克隆根据Genebank报道的人血清白蛋白编码基因序列分别设计引物HSAl和HSA2，序 列见序列表1和表2。用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)方法从人肝 胎cDNA文库获得HSA cDNA，其中引物HSA2除包括HSA基因的3’末端序列外，还在其3’末 端加入了编码GlyGlyGlyGlySer接头肽的序列。PCR条件为100ul反应体系中，加入Iul 人肝胎 cDNA 文库，20umol/L 的 HSAl 和 HSA2 引物各 3ul，2mmol/L 的 dNTP，IOul，IOX 反应缓 冲液 IOul，Taqplusl DNA 聚合酶 5U。用 Perk-Elmer 公司的 9600PCR 仪，PCR 条件为 94°C 变性1分钟，55°C退火1分钟，72°C延伸3分钟，35个循环后，再72°C延伸10分钟。通过凝 胶电池分析反应物显出一预期大小(1.8KD)的条带，PCR产物电池纯化，用DNA片段回收试 剂盒回收纯化约1. 8KD的目标带。实施例2 =UOX基因的获得以质粒pET-32a_rasburicase为模板，设计如引物UOXl和U0X2，见序列表3和4。 以引物UOXl和U0X2扩增，即得到带有5肽接头和BamH I酶切位点的尿酸氧化酶基因。PCR 条件为94°C预变性5min，然后以94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸40s进行30个循 环，最后72°C 10min、4°C IOmin终止反应，回收基因片断。实施例3 =HSA-UOX融合基因的获得将得到的UOX基因片段回收作为模板，以HSA片段作为另一模板。以引物HSAl 和U0X2引物扩增，即获得带有BamH I和EcoR I酶切位点的HSA-UOX片段。PCR条件为 94°C预变性5min，然后以94°C变性30s、60°C退火30s、72°C延伸4min进行30个循环，最后 720C 10min、4°C IOmin终止反应，回收基因片断。实施例4 重组质粒pPIC9-HSA-U0X的构建和表达
用BamH I/EcoR I双酶切PCR产物和pPIC9载体，电泳纯化，回收酶切的基因片段 和载体，然后用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a，37 °C培养16h后进行鉴 定，并挑选阳性克隆测序。质粒构建流程见附图一。将构建好的表达载体pPIC9-HSA-U0X经Bgl II线性化后，电击转化到毕赤酵母 GS115宿主菌中，用选择性培养基MD筛选转化子。将阳性转化子接种到5mL YPD液体培养 基中，30°C培养过夜，再转接到BMGY液体培养基中，24h后加入0. 5%的甲醇进行诱导，诱导 约60h后离心收集上清，进行SDS-PAGE电泳分析。实施例5 表达产物的分离纯化培养上清超滤浓缩离心，样品上清液经截留相对分子质量为30kd的超滤管浓缩， 有利于减少样品体积以进行分子筛纯化。0. lmol/L、pH8. 0的磷酸盐缓冲液平衡S印hadex G-75分子筛，上样60min后收集蛋白峰，90min左右出现目的蛋白峰。实施例6 人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白对分离纯化后的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白进行SDS-PAGE电泳分析， 结果见附图二，经扫描分析人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白的分子量为lOlkd。免疫印 记分析，融合蛋白与人血清白蛋白抗体、尿酸氧化酶抗体呈阳性反应。分析纯化后尿酸氧化酶的活性，在3ml缓冲液体系中含尿酸0. 18 u mol, pH 8. 9， 30°C保温，检测波长292nm，每分钟将1 y mol尿酸氧化为尿囊酸所需的酶量为一个酶活性 单位。加入lmg/mL的酶1 y L，反应结束后测吸收值，根据标准曲线计算酶分解的尿酸，计算 酶比活性为4. lU/mg。序列表<110>杭州北斗生物技术有限公司<120>人血清白蛋白与尿酸氧化酶的融合蛋白<160>4<210>1<211 >42<212>DNA<213>人工序列<400>1HSA1 5' GC TTC GAAACC ATG ATG AAG TGG GTAACC TTTATT TCC CTT 3'<210>1<211 >41<212>DNA<213>人工序列<400>2HSA2 5' TA GGATCC ACC ACC ACC TAA GCC TAA GGC AGC TTG ACT TGC 3'<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列
U0X1 :5’ GGT GGT GGT GGATCC ATG TCC GCG GTT AAA GCA GCC CGC 3’<210>1<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>4U0X2 5' TCT GGATCC TTA CAATTTAGA CTT CAG A 3'
权利要求
一种人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白，其特征在于人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合蛋白由人血清白蛋白氨基酸序列、尿酸氧化酶氨基酸序列和连接肽组成，融合蛋白序列由人血清白蛋白氨基酸序列、尿酸氧化酶氨基酸序列通过连接肽连接。
2.根据权利要求1所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白，其特征在于人血清 白蛋白的氨基酸序列在融合蛋白的N端，尿酸氧化酶氨基酸序列在融合蛋白的C端；或者， 人血清白蛋白的氨基酸序列在融合蛋白的C端，尿酸氧化酶氨基酸序列在融合蛋白的N端， 两个蛋白质的氨基酸序列通过连接肽连接。
3.根据权利要求2所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白，其特征在于连接肽 氨基酸序列为[GlyGlyGlyGlySer]n，其中η为1_10的整数。
4.根据权利要求3所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白，其特征在于连接肽 氨基酸序列为[GlyGlyGlyGlySer]n，其中η为1_3的整数。
5.根据权利要求1-4任意一项权利要求所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白， 其特征在于尿酸氧化酶氨基酸序列是黄曲霉、球形节杆菌或假丝酵母来源的真菌或微生 物尿酸氧化酶及其突变体，或者，尿酸氧化酶氨基酸序列是来源于哺乳动物尿酸氧化酶序 列及其突变体；或者，尿酸氧化酶氨基酸序列是来源于果蝇的无脊椎动物的尿酸氧化酶序 列及其突变体；或者，尿酸氧化酶氨基酸序列是来源于植物的重组尿酸氧化酶及其突变体， 或者是这些序列不同片段的嵌合体。
6.根据权利要求5所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白，其特征在于尿酸氧 化酶为黄曲霉尿酸氧化酶。
7.根据权利要求1-6任意一项权利要求所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白， 其特征在于融合蛋白的分子量为90kd-105kd。
8.根据权利要求1-6任意一项权利要求所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白， 其特征在于融合蛋白的酶比活性为3. 0-8. OEAU/mg。
9.一种制备如权利要求1所述的人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白的方法，其特征 在于克隆人血清白蛋白和尿酸氧化酶基因，拼接获得人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋 白基因，构建重组质粒，转化酵母宿主菌，筛选获得工程菌株，培养工程菌，诱导人血清白蛋 白和尿酸氧化酶融合蛋白的表达，分离纯化获得人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白。
10.如权利要求9所述一种人血清白蛋白和尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法，其特征 在于分离纯化的方法包括超滤、盐析、沉淀、离心、透析、离子交换层析、疏水层析、亲和层 析、反相层析、分子筛层析技术中的一种或几种。
全文摘要
本发明公开了一种人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合蛋白及其制备方法，其特征在于人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合蛋白由人血清白蛋白氨基酸序列、尿酸氧化酶氨基酸序列和连接肽组成，融合蛋白序列由人血清白蛋白氨基酸序列、尿酸氧化酶氨基酸序列通过连接肽连接，人血清白蛋白的氨基酸序列在融合蛋白的N端，尿酸氧化酶氨基酸序列在融合蛋白的C端；或者，人血清白蛋白的氨基酸序列在融合蛋白的C端，尿酸氧化酶氨基酸序列在融合蛋白的N端，两个蛋白质的氨基酸序列通过连接肽连接。人血清白蛋白和尿酸氧化酶的融合蛋白半衰期长，是一种尿酸氧化酶新型制剂。
文档编号C12N15/81GK101875923SQ20091021544
公开日2010年11月3日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者刘国安, 刘沐荣, 刘翔, 张加慧, 张弨, 胡芬芬 申请人:杭州北斗生物技术有限公司