专利名称：：一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法以及其在制备止血或预防出血药物中的应用。
背景技术：
：蛇毒类凝血酶(TLE)是从蛇毒中的一类具有类凝血酶活性的蛋白酶，能特异性地水解纤维蛋白原形成纤维蛋白单体而促使血液凝固。KornalicF等将以纤维蛋白原为底物的蛇毒酶按其作用机理分成三类1类是类凝血酶(Thrombin-likeenzyme,TLE)或凝血蛋白酶(Thrombicprotease)，它仅分解纤维蛋白原的α链和/或β链的N端肽链，释放A肽(α链)和/或B肽(β链)，使血液凝固。II类是纤维蛋白原裂解酶(Fibrinogenolyticenzyme)，它直接从纤维蛋白原三条肽链(α，β和γ)的C端水解，将纤原分解成碎片，血液不被凝固。III类是纤溶酶原激活酶(Enzymeactivatingplasminogen)，它是纤维蛋白溶解的间接激活剂，它通过激活纤溶酶原产生纤溶酶，来裂解纤维蛋白或纤维蛋白原。国内外已经批准用于止血的类凝血酶药物主要是立芷雪。由瑞士巴塞素高大药厂研制的商品名为立芷雪Oteptilase)的止血药物是从巴西蛇毒Bathropsatrox中提取的类凝血酶。由于立芷雪疗效确切，副作用小，临床适应症广，优于其它止血药等特点，于1996年进入中国国家基本药物目录，所以我国每年需从瑞士进口大量立芷雪用于临床。自从立芷雪Oteptilase)进入中国以来，国内许多研究者都尝试过寻找类似的止血成分。2001年，由沈阳赛诺科技发展有限公司、长春市斯达生物技术有限责任公司和北京赛生科技发展有限公司联合，在国内成功地使用进口巴西Bathropsatrox蛇毒生产立芷雪产品，市场名巴曲停，英文名Hemocoagulase。2005年辽宁锦州医学院牟萍等自长白山白眉蝮蛇(Agkistrodonblomhoffiiussurensis)蛇毒中提取35.5KDa的具有止血活性的类凝血酶，该类凝血酶N端15个氨基酸残基与立芷雪相同，该类凝血酶仿制立芷雪，被发展成商品名为邦停上市。尖吻蝮蛇(Deinagkistrodonacutus)又称五步蛇或蕲蛇，分布在华南各省。其蛇毒中的精氨酸酯酶活性较低，无神经毒和激肽释放酶活性。在其组份中，以纤维蛋白原为底物的酶分布十分丰富，这些酶在体外能使人血浆和牛纤原凝结，但在体内却引起各种不同的生理效应如降纤抗凝、血小板聚集、血管出血和止血等。尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的研究，最早是1967年的ChengHC和OuyangC等，他们于1971年和1972年相继分离出两个类凝血酶组份，经动物实验验证，它们均有不同程度抗凝作用，其中的Acutin分子量41KDa，后被发展成降纤酶。肖昌华等从1988年起和管锦华等从1992年起，也多次尝试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离使动物凝血时间缩短的组份。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种具有止血活性或者预防出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。本发明的第二个目的是提供一种制备该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法。本发明经过以下步骤从尖吻蝮蛇蛇毒中制备尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶a)尖吻蝮蛇蛇毒用磷酸盐缓冲液溶解，离心，上清液上S印hadexG_75凝胶柱，磷酸盐缓冲液洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；b)将a)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰上第一次DEAE-SepharoseFastFlow柱，用含有0_0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；C)将b)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析，透析样上第二次DEAE-S^haroseFastFlow柱，用含0.025-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；d)将C)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析，透析样上第三次DEAE-S印haroseFastFlow柱，用含0.025-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰，收集的有效峰经脱盐，冻干后即为该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯品。上述制备方法的优选条件为a)步骤中所述的尖吻蝮蛇蛇毒是用0.01M,pH值为6.8的磷酸盐缓冲液溶解，离心条件为6000rpm和20min，SephadexG-75凝胶柱是用0.01M,PH值为6.8的磷酸盐缓冲液洗脱；b)步骤中含有0-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为0.01M、pH值为6.8；c)步骤中的所述用磷酸盐缓冲液透析是用0.01M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液，透析24h，所述含0.025-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为0.01M、pH值为6.8；d)步骤中的所述用磷酸盐缓冲液透析是用0.01M,pH值为7.8的磷酸盐缓冲液，透析24h，所述含0.025-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为0.01M、pH值为7.8，所述的脱盐是用S印hadexG-25凝胶柱脱盐。制备出的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶经N端氨基酸残基测序发现，其N端44个氨基酸残基为VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC(具体如SEQIDNO.1所示)；SDS-PAGE(TC=123.9)法测定的分子量为37KDa；用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得其精确分子量为31084Da；等点电4.28；最适温度37°C；最适pH6.6；血浆凝结比活约为560单位/毫克。与现有的几种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶比较发现，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶与现有的几种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶分子大小和结构都不同。BLAST比较发现，与其同源性最高的为Dav-X蛋白酶，同源性为35/44(80%)。由此可见，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶是一种新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。动物药效试验表明，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶能够显著缩短新西兰大耳兔的全血凝固时间，使血纤维蛋白原含量减少，对活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、血小板数量和释放活性、优球蛋白溶解时间(ELT)都没有明显影响。由此表明，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)具有止血功能，不影响血液中凝血因子II、VIII和血小板，无血栓形成危险。毒理学研究表明，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的毒性极低。本发明的第三个目的是提供尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶在制备止血或预防出血药物中的应用。本发明的第四个目的是提供一种止血或预防出血的药物，该药物含有本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶作为活性成份。该药物可以含有一种或者多种药学上可以接受的辅料。本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)作为一种新的蛋白类止血药，其作用方式与立芷雪Oteptilase)相似，能使人血浆和牛纤维蛋白原在体外凝固，不激活凝血因子VIII和II，产生可溶性非交联纤维蛋白单体。在伤口处，该单体与其它凝血因子相互作用加速止血效应，在完整血管内，该单体有几分钟半衰期，可迅速被纤溶酶降解清除。该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)在体外使柠檬酸化血浆凝固，在体内可使出凝血时间显著缩短，同时又不造成血栓形成，达到伤口部位的止血或预防出血之目的，并且其毒性非常低，因此可以作为一种安全有效的止血药物，适于临床上各种类型的出血性疾病的预防和治疗。图1是尖吻蝮蛇蛇毒的S印hadexG_75凝胶洗脱峰图。图2是对SephadexG-75凝胶洗脱峰的有效峰上第一次DEAE-S印haroseFastFlow离子交换柱的洗脱峰图。图3是经第一次透析后，样品上第二次DEAE-S印haroseFastFlow离子交换柱洗脱峰图。图4是经第二次透析后，样品上第三次DEAE-S印haroseFastFlow离子交换柱洗脱峰图。图5是尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的SDS-PAGE分析图，泳道1、2、3、4分别代表尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)上样量60μg、40μg、30μg、10μg，泳道5为Acutin，泳道6为标准分子量蛋白(14.497.4KDa)。图6是尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)凝胶正相HPLC图。图7是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(BiflexIII型MALDL-T0F质谱仪，BrukerDaltonicsCo)测尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)精确分子量的图谱。图8是尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的等电聚焦电泳图，泳道1为标准等电点蛋白；泳道2为尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)；泳道3为牛血清白蛋白(BSA)。图9是该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的温度_活性曲线图。图10是该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的pH-活性曲线图。图11:A是尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)裂解牛纤维蛋白原的SDS-PAGE图，其中1为未加尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的牛纤维蛋白原对照，2、3、4、5分别为尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)与牛纤维蛋白原混合后，保温lh、2h、3h、4h后的样品；B是猪凝血酶裂解牛纤维蛋白原的SDS-PAGE图，其中1为未加猪凝血酶的牛纤维蛋白原对照，2、3、4、5分别为猪凝血酶与牛纤维蛋白原混合后，保温lh、2h、3h、4h后的样品。具体实施例方式实施例11、尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的制备10gX2尖吻蝮蛇蛇毒干粉(购自广州市新源蛇毒经销部)溶解于200ml0.OlM磷酸盐缓冲液中(pH6.8)，6000rpm离心20min。上清液上S印hadexG-75凝胶柱(7XIOOcm层析柱)，实验条件洗脱用0.OlM磷酸盐缓冲液(pH6.8)，流速为6ml/min，收集蛋白洗脱峰，如图1所示，有效峰为洗脱峰2(Fraction-2)。收集的有效峰上第一次DEAE-S^haroseFastFlow离子交换柱(3X20cm层析柱)，实验条件洗脱用含0-0.05MNaCl的0.OlM磷酸盐缓冲液(pH6.8)线性梯度洗脱，流速为30ml/min，梯度杯2000mlX2，收集蛋白洗脱峰，如图2所示，有效峰为洗脱峰3(Fraction-3)。有效峰经0.OlM磷酸盐缓冲液(pH6.8)透析24h后，透析样品上第二次DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱，实验条件洗脱用含0.025-0.05MNaCl的0.OlM磷酸盐缓冲液(pH=6.8)线性梯度洗脱，流速为30ml/min，梯度杯2000mlX2，收集蛋白洗脱峰，如图3所示，有效峰为洗脱峰1(Fraction-I)。有效峰经0.OlM磷酸盐缓冲液(pH7.8)透析24h后，透析样上第三次DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱，实验条件洗脱用含0.025-0.05MNaCl的0.OlM磷酸盐缓冲液(PH=7.8)线性梯度洗脱，流速为30ml/min，梯度杯2000mlX2，收集蛋白洗脱峰，如图4所示，有效峰为洗脱峰1(Fraction-Ι)，该洗脱峰即为纯化的样品。将纯化的样品经S印hadexG-25柱脱盐和冻干后，即获得终纯品。终纯品的检测SDS-PAGE(TC=124.9)检测，如图5所示，样品的电泳带为单一条带。如图6所示，凝胶正相HPLC(色谱柱BI0SEPSEC-S2000,Phenomenx型号，7.8X300mm，Pharmacia-LKBCo.；色谱仪岛津LC-IOA)，洗脱为0.2M磷酸盐缓冲液(ρΗ6·8)，lml/min流速和280nm的检测波长，检测为单一峰。表明经过上述方法获得的终纯品是只含有单一蛋白的纯品，即为尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯品。1单位的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)是指在37°C保温条件下，使0.2ml人新鲜血浆在60士5秒凝结的酶量。按照上述定义，测得尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的酶活为580U/mg。制备过程总结如表1所示表1制备工艺的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、生物化学参数以及结构特征(本部分的测定方法都为本领域技术人员的通用方法，可参考中国药典以及生物化学实验技术等教科书)以上工艺制备的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)，通过SDS-PAGE法测其分子量为37kDa，如图5所示；正向凝胶HPLC成单峰，如图6所示；用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(BiflexIII型MALDL-T0F质谱仪，BrukerDaltonicsCo)，测得其精确分子量为31084Da，如图7所示；通过等电聚焦电泳研究，其等点电为4.28，如图8所示；对尖吻蝮蛇类蛇毒凝血酶(Agacutase)进行温度-活性实验，凝结实验条件0.2ml人拘橼酸化血浆+0.2ml尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)溶液(0.2U)，不同温度保温测活，如图9所示，其最适温度为37°C；对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)进行pH_活性实验，凝结实验条件0.2ml人拘橼酸化血浆+0.2ml不同pH的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)溶液(0.2U)，37°C保温测活，如图10所示，测得其最适pH为6.6；血浆凝结比活约为560单位/毫克，实验条件0.2ml含一定浓度的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)+0.2ml人拘橼酸化血浆，37°C保温测活，计算出一毫克酶的血浆凝结活性单位数；对该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(A-gacutase)的N端进行测序，其N端44个氨基酸残基为VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC(具体如SEQIDNO.1所示)。本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶与现有的几种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶具有明显不同的分子大小和结构。BLAST比较显示，与其同源性最高的为Dav-X蛋白酶，有35/44(80%)的同源性。由此表明，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶是一种新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。3、药效学试验(1)实验材料用以上工艺制备的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)制成冻干粉剂成品，每支成品含1单位尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)和(质量分数)右旋糖苷40。新西兰白兔，2_3kg体重，雌雄兼有，由南方医科大学动物中心提供。立芷雪(R印tilase)，批号770604，市售，1单位/瓶，瑞士巴塞尔素高大药厂生产。(2)实验方法和结果(a)含有尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)制成冻干粉剂成品与作为阳性对照的立芷雪Oteptilase)粉剂，分别用灭菌注射用水溶解。然后从新西兰白兔耳静脉注射给药，实验采用三个剂量组，即0.03U/kg，0.06U/kg，0.12U/kg，在给药前和药后的10min，2h，4h，8h，24h，直接心脏取血，检测全血凝固时间、血纤维蛋白原含量、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、血小板计数和释放活性、优球蛋白溶解时间(ELT)。实验结果如下列表所示表2尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)对新西兰全血凝固时间的影响G士s，η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>^P<0.05，给药前后的Dunnett氏t检验表3尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)对新西兰白兔血纤维蛋白原含量的影口向(E±s，η=6)静脉给药前后血纤维蛋白原含量(g/1)组别(U/kg)给药前IOmin2h4h8h24hF值Agacutase0.033.89士0.593.24土0.693.53士0.892.55士0.712.78土0.653.65±0.992.56Agacutase0.063.12士0.233.30土0.542,61士0.423.09士0.212.32±0.663.61士0.712.60Agacutase0.123.41±0.512.99士0.763.12±0.692.91士0.222.53士0.612.77士0.322.24Reptilase0.063.18士0.323.23土0.703.01士0.563.31±0.773.14±0.654.U士0.912.23表4尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)对新西兰白兔APTT的影响(I士s，n=6)静脉给药前后的APTT(秒)组别(U/kg)给药前IOmin2h4h8h24hF值Agacutase0.0315.8士2.114.9士2.415.9土2.116.5±1.917.1±1.817.8士2.00.87Agacutase0.0615.9士1.714.5±1.5*14.8士1.6*I4.0±0.6*15.7士2.113.1±1,3*8.23Agacutase0.1215.9士2.015.3士2‘114.9士3.113.2士1.515.2±1.615.6士2.22.34ReptiIase0.0617.5士2.〗13,7士1.5*13.7士1.0*14.0士1.3*14.4±1.1*14.5土2.34.89*P<0.05，给药前后Dunnett氏t检验表5尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)对新西兰白兔PT的影响(I士s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*P<0.05，给药前后的Dunnett氏t检验表6尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)对新西兰白兔TT的影响6[士s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*P<0.05，给药前后Dunnett氏t检验表7尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶对家兔血小板聚集率的影响(％)G士s，η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表8尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶对新西兰白兔血小板数量的影响G士s，η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表9尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶静注对新西兰白兔优球蛋白溶解时间的影响G士S，η=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>检测结果表明，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)能显著缩短全血凝固时间(见表2)，能不同程度减少血纤维蛋白原含量(见表3)，对活化部分凝血活酶时间(APTT)(见表4)几乎不影响，对凝血酶原时间(PT)(见表5)、凝血酶时间(TT)(见表6)、血小板数量(见表8)和释放活性(见表7)、对优球蛋白溶解时间(ELT)(见表9)都没有明显影响。由此说明，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)具有止血功能，并且不影响血液中凝血因子II、IV和血小板，无血栓形成危险。与阳性对照立芷雪(Iteptilase)比较，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)止血药效时间长达24小时，而立芷雪仅为8小时，效果明显好于立芷雪Oteptilase)(b)将尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)溶于50mM的Tris-HCl(pH6.6)中，配置成ΙΟυ/ΙΟΟμ1的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)溶液，然后将100μ1尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)溶液与100μ1的牛纤维蛋白原1μg/μ1，溶解于50mM的Tris-HCl(pH6.6)缓冲液中混合，37°C保温，分别在1、2、3、4小时后取样用SDS-PAGE(ΤC=83.9)鉴定，以猪凝血酶(lU/ΙΟΟμΙ)在相同处理条件下的牛纤维蛋白原作为对照。如图11所示，图IlA是用尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)处理，图IlB是用猪凝血酶处理，由上述图结果可看出，本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)只裂解牛纤维蛋白原的α链，对β和Y链没影响，而猪凝血酶裂解牛纤维蛋白原的α链和β链。由此可见，尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)是通过分解纤维蛋白原的α链形成纤维蛋白肽A而引起止血反应的。(C)小鼠剪尾出血时间的测定取小白鼠随机分成3组，每组6只，一组为尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)实验组，一组为立芷雪(R印tilase)阳性对照组，一组为生理盐水组做对照，静脉注射后，在距离鼠尾尖约0.5cm处快速剪断，立即按表计时，用滤纸片随机吸取流出的血液，直到出血停止。出血时间的计算是从剪尾开始至无出血为止。表10尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)对小鼠剪尾出血时间的影响(^士s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*P<0.05，与生理盐水组相比的t检验结果如表10所示，尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)能够显著缩短小鼠剪尾出血时间，与立芷雪(R印tilase)比较，其出血时间明显缩短。4、毒理学实验(a)最大耐受剂量将尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)溶液静脉注射小白鼠(17_22g，雌雄兼有)，受试动物观察两周，有无死亡。试验以立芷雪(R印tilase)作对照，结果如下表11小白鼠对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)最大耐受剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>如表11所示，尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的最大耐受剂量为60U/kg，而立芷雪(R印tilase)的最大耐受剂量为35U/kg，表明尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的毒性明显低于立芷雪(R印tilase)。(b)过敏反应将6只豚鼠分别在1、3、5天腹腔注射一定剂量的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)，在第一次注射后的第14天和21天，分别取3只豚鼠，一次性静脉注射酶溶液，注射剂量翻倍，观查豚鼠有无过敏反应。实验以立芷雪(R印tilase)、0.9%NaCl溶液和牛血清白蛋白(BSA)作为对照，实验结果如下表12过敏反应实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>如表12所示，当尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的致敏剂量到4U/kg时候才会产生过敏反应，而立芷雪(R印tilase)的质量标准过敏剂量是0.25U/kg。由此可见，其尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)的毒性非常低。毒理学研究表明本发明的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶(Agacutase)是一种非常安全的止血药物。序列表<110>唐松山<120>一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶及其制备方法和应用<160>1<210>1<211>44<212>PRT<213>(Deinagkistrodonacutus)<400>1VallieGlyGlyAsnGluCysAspThrAsn1510AlaAlaPhePheThrSerArgProTrplie2025ThrLeulieHisGluGluTrpValLeuAla3540GluHisArgPheLeu15PheGinCysAlaGly30AlaAlaHisCys4权利要求一种尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶，其特征在于该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶为单肽链，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得其精确分子量为31084Da，SDS-PAGE法测得其分子量为37KDa，其N端44个氨基酸残基序列为VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC，等点电为4.28，最适温度37℃，最适pH6.6，血浆凝结比活为560单位/毫克。2.权利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶在制备止血或预防出血药物中的应用。3.—种止血或预防出血药物，其特征在于该药物含有权利要求1所述的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶作为活性成份。4.一种制备权利要求1所述尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法，其特征在于包括以下步骤a)尖吻蝮蛇蛇毒用磷酸盐缓冲液溶解，离心，上清液上S印hadexG_75凝胶柱，磷酸盐缓冲液洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；b)将a)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰上第一次DEAE-S印haroseFastFlow柱，用含有0-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；c)将b)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析，透析样上第二次DEAE-S^haroseFastFlow柱，用含0.025-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰；d)将c)步骤收集的含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰用磷酸盐缓冲液透析，透析样上第三次DEAE-S^haroseFastFlow柱，用含0.025-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，收集含该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的有效峰，收集的有效峰经脱盐，冻干后即为该尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶纯品。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于a)步骤中所述的尖吻蝮蛇蛇毒是用0.01M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液溶解，离心条件为6000rpm和20min，SephadexG-75凝胶柱是用0.01M，pH值为6.8的磷酸盐缓冲液洗脱；b)步骤中含有0-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液，浓度为0.01M、pH值为6.8；c)步骤中的所述用磷酸盐缓冲液透析是用0.01M,pH值为6.8的磷酸盐缓冲液，透析24h，所述含0.025-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为0.01M、pH值为6.8；d)步骤中所述用磷酸盐缓冲液透析是用0.01M，pH值为7.8的磷酸盐缓冲液，透析24h，所述含0.025-0.05MNaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为0.01M、pH值为7.8，所述的脱盐是用Si^phadexG-25凝胶柱脱盐。全文摘要本发明公开了一种具有止血活性或者预防出血的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶。该类凝血酶为单肽链，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得其精确分子量为31084Da、SDS-PAGE测得分子量为37KDa，其N端44个氨基酸残基序列为VIGGNECDTNEHRFLAAFFTSRPWIFQCAGTLIHEEWVLAAAHC，等点电4.28，最适温度37℃，最适pH6.6和血浆凝结比活560单位/毫克。它具有止血功能，不影响血液中凝血因子II、VIII和血小板，无血栓形成危险。毒理学研究显示，与立芷雪比较，其毒性非常低。可以作为安全有效的止血药物，适用于临床出血性疾病的治疗和预防。文档编号C12N9/64GK101812436SQ20091021439公开日2010年8月25日申请日期2009年12月30日优先权日2009年12月30日发明者唐松山申请人:唐松山