专利名称：一种来源于矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法
技术领域：
本发明涉及酶及其提取方法，特别是提供一种来源于矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法。
背景技术：
凝血酶原激活物是由活化的凝血因子Xa、Va, Ca2+及磷脂胶粒构成的复合体。因子χ被激活为Xa是此过程的关键步骤。因子Va无酶活性，但可使Xa的活性增强350倍，加速凝血酶的生成。磷脂胶粒与酶(Xa)和底物(凝血酶原)之间借Ca2+作为桥相连。因凝血酶原肽链的N未端含有10个 γ羧基谷氨酸残基。相邻的羧基可与Ca2+形成复合体。另一方面，Ca2+又可与磷脂中磷酸基结合，这样使Xa和Va与凝血酶原接触在一起，于是Xa将凝血酶原水解为凝血酶。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于矛头蝮蛇蛇毒的凝血酶原激活酶。本发明为解决上述技术问题，采取以下技术方案一种凝血酶原激活酶，是将矛头蝮蛇蛇毒依次进行SP离子交换层析、纤维素DEAE-S印hroseFast Flow离子交换层析和 Sephadex-G75凝胶过滤层析后收集的具有凝血酶原激活酶活性的蛋白。本发明所述来源于矛头蝮蛇蛇毒的凝血酶原激活酶具有以下特点凝血酶原激活物是由活化的凝血因子Xa、Va、Ca2+及磷脂胶粒构成的复合体。因子X被激活为Xa是此过程的关键步骤。本发明所述凝血酶原激活物提取方法，包括以下步骤(1)将矛头蝮蛇蛇毒溶于pH6. 0、0. 05mol/L的PBS缓冲液中，得到浓度为 100-120g/L的矛头蝮蛇蛇毒液；(2)对步骤(1)获得的矛头蝮蛇蛇毒液进行离子交换层析，固相填充物为SP,洗脱液分别为 ρΗ6· 0、0· 05mol/L 的 PBS 缓冲液和含 0. 25mol/LNaCl 的 ρΗ6· 0、0· 05mol/L 的 PBS 缓冲液，直线洗脱；(3)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光广度检测，得到吸收图谱，收集含有凝血酶原激活酶的部分；(4)浓缩除盐，用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液超滤浓缩并去除NaCl ；(5)再次离子交换层析，步骤(4)的浓缩液进行离子交换层析，固相填充物为纤维素固相填充物为DEAE-S印harose Fast Flow，洗脱液为含0-0. 2mol/L NaCl的pH7_8、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱；(6)将步骤(5)获得的洗脱液各峰进行SDS-PAGE凝胶电泳和活性测定，收集含有凝血酶原激活酶部分；(7)再次浓缩除盐，用pH7.5、0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液超滤浓缩并去除 NaCl ；
(8)将步骤(7)浓缩液进行凝胶过滤层析，固相填充物为S印hadeX-G75，洗脱液为 PH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液，收集洗脱液，从中收集含有凝血酶原激活酶部分，得到矛头蝮蛇凝血酶原激活物原液。本发明所述凝血酶原激活物提取方法中，步骤(1)为获得更好的实施效果，可先用离心的方法去除矛头蝮蛇蛇毒液中的杂质，离心条件可根据实际情况进行选择，如在 4500rpm 下离心 15min。本发明所述凝血酶原激活物提取方法中，步骤(2)中的中SP离子交换层析柱在使用前，先用ρΗ6· 0、0· 05mol/L的PBS缓冲液平衡5-6小时，流速为3. Oml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后用PH6. 0、 0. 05mol/L的PBS缓冲液过柱洗脱，然后用含0. 25mol/LNaCl的pH6. 0,0. 05mol/L的PBS缓冲液进行直线洗脱，流速为3. Oml/min ；本发明所述凝血酶原激活物提取方法中，步骤(3)中的收集方法可为依据280nm 下紫外分光广度检测图谱手动收集；具有凝血酶原激活酶部分的检测方法为=SDS-PAGE电泳和凝血活性检测。本发明所述凝血酶原激活物提取方法中，步骤(4)浓缩除盐可选用截止值10000 分子量膜切向流超滤，通过用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释、超滤浓缩，再稀释再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度。本发明所述凝血酶原激活物提取方法中，步骤(5)中纤维素DEAE-S印harose Fast Flow离子交换层析柱在使用前，先用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时， 流速为3. Oml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 2mol/LNaCl 的pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱，流速为3. Oml/min ；所述步骤 (5)中的Tris-HCl缓冲液优选为ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液·。本发明所述凝血酶原激活物提取方法中，步骤(8)中S印hadeX-G75层析柱使用前，先用PH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时，流速为3. Oml/min,层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱，流速为3. Oml/ min，用与步骤(3)相同的方法收集洗脱液中含有凝血酶原激活酶的部分。本发明提供了一种从矛头蝮蛇毒液中提取到的凝血酶原激活酶。所述凝血酶原激活酶具有以下特点(1)凝血酶原激活物是由活化的凝血因子Xa、Va、Ca2+及磷脂胶粒构成的复合体；(2)该激活物的提取方法以常规的层析技术为主，通过变换层析条件和调节技术参数实现精确分离的目的，且可以在常温下进行操作，并具有条件简单容易放大，成本低(选择的层析胶可以反复利用)，收率高和产品纯度高的优点。基于上述特点，可以利用本发明的凝血酶原激活酶为活性成分制备治疗外科出血、内科出血、妇产科出血、五官科出血、儿科出血和组织活检后出血等临床出血及出血性疾病的药物，将在生物制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1本实施例所述凝血酶原激活物的提取方法为取IOg矛头蝮蛇蛇毒干粉(批号080709)，用IOOml预冷的pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液于4_8°C的层析柜中搅拌溶解 30min,4500rpm离心15min，取上清液。层析前先将SP层析柱用pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液平衡5-6小时，流速为3ml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后用pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液过柱洗脱，然后用含0. 25mol/LNaCl的pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液进行直线洗脱，流速为3. Oml/min ； 依据280nm下紫外分光广度检测图谱手动收集，经电泳分析和凝血活性测定具有凝血酶原激活酶部分，合并洗脱液，共得270ml，用截止值10000分子量膜切向流超滤，通过用pH7、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释、超滤浓缩，再稀释再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度，浓缩样品50ml ；上样至纤维素纤DEAE-S印harose Fast Flow 离子交换层析柱在使用前，先用pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时，流速为3. Oml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后pH7、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 2mol/LNaCl的pH7、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱，流速为3. Oml/min ；再次用ρΗ7· 5、0· Olmol/ L的Tris-HCl缓冲液浓缩除盐，浓缩样品40ml，然后上样S印hadeX-G75层析柱，每次上样 10ml，先用 ρΗ7· 5、0· 01mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液平衡 5-6 小时，流速为 3. Oml/min, B 析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱，流速为 3. Oml/min。收集样品165ml，收获蛋白58mg，HPLC分析纯度为97.7%，SDS-PAGE为一条带。实施例2本实施例所述凝血酶原激活物的提取方法为取IOg矛头蝮蛇蛇毒干粉(批号080709)，用100ml预冷的pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液于4_8°C的层析柜中搅拌溶解 30min,4500rpm离心15min，取上清液。层析前先将SP层析柱用pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液平衡5-6小时，流速为3ml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后用pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液过柱洗脱，然后用含0. 25mol/LNaCl的pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液进行直线洗脱，流速为3. Oml/min ； 依据280nm下紫外分光广度检测图谱手动收集，经电泳分析和凝血活性测定具有凝血酶原激活酶部分，合并洗脱液，共得270ml，用截止值10000分子量膜切向流超滤，通过用pH7、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释、超滤浓缩，再稀释再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度，浓缩样品50ml ；上样至纤维素纤DEAE-S印harose Fast Flow 离子交换层析柱在使用前，先用PH7. 5,0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时，流速为3. Oml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后PH7. 5、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 2mol/LNaCl的 ρΗ7· 5、0· 05mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱，流速为3. Oml/min ；再次用ρΗ7· 5、 0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液浓缩除盐，浓缩样品40ml，然后上样S印hadeX-G75层析柱， 每次上样10ml，先用ρΗ7· 5、0· 01mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5-6小时，流速为3. Oml/ min，层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱， 流速为3. Oml/min。收集样品202ml，收获蛋白65mg，HPLC分析纯度为98. 6%, SDS-PAGE为一条带。
实施例3本实施例所述凝血酶原激活物的提取方法为取IOg矛头蝮蛇蛇毒干粉(批号080709)，用IOOml预冷的pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液于4_8°C的层析柜中搅拌溶解 30min,4500rpm离心15min，取上清液。层析前先将SP层析柱用pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液平衡5-6小时，流速为3ml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后用pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液过柱洗脱，然后用含0. 25mol/LNaCl的pH6、0. 05mol/L的PBS缓冲液进行直线洗脱，流速为3. Oml/min ； 依据280nm下紫外分光广度检测图谱手动收集，经电泳分析和凝血活性测定具有凝血酶原激活酶部分，合并洗脱液，共得270ml，用截止值10000分子量膜切向流超滤，通过用pH7、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释、超滤浓缩，再稀释再超滤浓缩的方式以去除小分子多肽和脱盐降低溶液离子强度，浓缩样品50ml ；上样至纤维素纤DEAE-S印harose Fast Flow 离子交换层析柱在使用前，先用pH8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6小时，流速为3. Oml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后pH8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0. 2mol/LNaCl的pH8、 0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱，流速为3. Oml/min ；再次用ρΗ7· 5、0· Olmol/ L的Tris-HCl缓冲液浓缩除盐，浓缩样品40ml，然后上样S印hadeX-G75层析柱，每次上样 10ml，先用 ρΗ7· 5、0· 01mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液平衡 5-6 小时，流速为 3. Oml/min, B 析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱，流速为 3. Oml/min。收集样品182ml，收获蛋白55mg, HPLC分析纯度为98%, SDS-PAGE为一条带。
权利要求
1.一种来源于矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法，其特征在于所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物，是将矛头蝮蛇蛇毒依次进行SP离子交换层析、纤维素DEAE-Si5Phrose Fast Flow离子交换层析和S印hadeX-G75凝胶过滤层析后收集的具有凝血酶原激活酶活性的蛋白；所述第一次SP离子交换层析分别用pH6.0、0. 05mol/L的PBS缓冲液和含0. 25mol/LNaCl的pH6. 0,0. 05mol/L的PBS缓冲液进行直线洗脱；所述纤维素 DEAE-Sephrose FastFlow 离子交换层析用 pH7_8、0. 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含0. 2mol/LNaCl的pH7_8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱；所述 Sephadex-G75凝胶过滤层析用pH7. 5,0. Olmol/L的Tris-HCl缓冲液洗脱。
2.按照权利要求1所述来源于矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法其特征在于所述凝血酶原激活物是由活化的凝血因子Xa、Va、Ca2+及磷脂胶粒构成的复合体；因子X被激活为Xa是此过程的关键步骤。
3.按照权利要求1所述来源于矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法其特征在于所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的制备的步骤为(1)蛇毒预处理；(2)将预处理蛇毒进行离子交换层析，固相填充物为SP，分别用pH6.0,0. 05mol/L的 PBS缓冲液和含0. 25mol/LNaCl的pH6. 0,0. 05mol/L的PBS缓冲液进行直线洗脱；(3)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光广度检测，得到吸收图谱， 收集含有凝血酶原激活酶的部分；(4)将上述洗脱液进行超滤浓缩去除NaCl；(5)再次离子交换层析，步骤4)的浓缩液进行离子交换层析，固相填充物为 DEAE-Sephrose Fast Flow，用 ρΗ7_8、0· 05mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液和等量的含 0. 2mol/ LNaCl的pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱；(6)收集洗脱液，在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光广度检测，得到吸收图谱， 收集含有凝血酶原激活酶的部分；(7)超滤浓缩去除NaCl；(8)将步骤(7)浓缩液进行凝胶过滤层析，固相填充物为S印hadeX-G75，洗脱液为 pH7. 5、0. Olmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液。
4.按照权利要求3所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的制备步骤，其特征在于所述步骤(1)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的PH6. 0、0. 05mol/L的PBS缓冲液溶解；步骤(1)还包括用离心的方法去除矛头蝮蛇蛇毒液中的杂质的步骤。
5.按照权利要求1所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的制备步骤，其特征在于步骤(2) 中SP离子交换层析柱在使用前，先用pH6. 0、0. 05mol/L的PBS缓冲液平衡5_6小时，流速为3. Oml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后分别用ρΗ6· 0、0· 05mol/L的PBS缓冲液和含0. 25mol/LNaCl的ρΗ6· 0、 0. 05mol/L的PBS缓冲液进行直线洗脱，流速为3. Oml/min。
6.按照权利要求1所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的制备步骤，其特征在于所述步骤(3)中的收集方法为依据280nm下紫外分光广度检测图谱手动收集；具有凝血酶原激活酶活性部分的检测方法为将等体积并预热至37°C的收集液和质控血浆混合在37°C下水浴，能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血酶原激活酶活性的，再进行SDS-PAGE凝胶电泳确认。
7.按照权利要求1所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的制备步骤，其特征在于所述步骤(4)中的浓缩方法为用pH7-8、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液超滤浓缩并去除NaCl。
8.按照权利要求1所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的制备步骤，其特征在于所述步骤(5)中纤维素DEAE-S印hrose Fast Flow层析柱在使用前，先用pH7_8、0. 05mol/L的 Tris-HCl缓冲液平衡5-6小时，流速为3. Oml/min ；层析时，待矛头蝮蛇毒液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液，然后进行直线梯度洗脱，流速为3. Oml/ min，用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中含有凝血酶原激活酶的部分。
9.按照权利要求1所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的制备步骤，其特征在于所述步骤(7)中的浓缩方法为用pH7. 5、0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液超滤浓缩并去除NaCl。
10.按照权利要求1所述矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的制备步骤，其特征在于所述步骤(8)中S印hadex-G75层析柱使用前，先用pH7. 5,0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡5_6 小时，流速为3. Oml/min，层析时，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面上方加与平衡液相同的缓冲液洗脱，流速为3. Oml/min，用与步骤(3)相同的方法收集洗脱液中含有凝血酶原激活酶的部分。
全文摘要
一种来源于矛头蝮蛇蛇毒的凝血酶原激活物提取方法，该酶是将矛头蝮蛇蛇毒依次进行SP离子交换层析、透析、纤维素DEAE-Sephrose Fast Flow离子交换层析和Sephadex-G75凝胶过滤层析后收集的具有凝血酶原激活酶活性的蛋白。以本发明的凝血凝血酶原激活酶为活性成分制备治疗外科出血、内科出血、妇产科出血、五官科出血、儿科出血和组织活检后出血等临床出血及出血性疾病的药物，将在生物制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N9/48GK102242098SQ20101016673
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2010年5月10日
发明者崔亮亮, 曹丽丽, 李秀娜, 王宏英, 石皎, 薛百忠, 薛雁 申请人:辽宁诺康医药有限公司