专利名称：：一种定点突变的基因工程巴曲酶及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因重组方法制备定点突变的巴曲酶~~Batroxobin。其关键是巴曲酶基因的定点改造、合成、克隆、表达及产物的发酵表达和分离纯化制备。突变的巴曲酶既可以作为止血药的主要成份，也可以直接用作止血药物。
背景技术：
：自1963年奥地利学者VonKlobusitzky首次从巴西矛头蝮蛇(5o决ra/w^rax)毒液中分离得到一种丝氨酸蛋白水解酶(类凝血酶)，也就是所说的巴曲酶。至今已发现30多种蛇毒中含有类凝血酶组份，并有20多种先后得到分离和纯化，它们都能作用于哺乳动物血浆中纤维蛋白原A链中的Arg"-Gly"间的肽键，释放出纤维蛋白肽A，从而快速地将血液中的纤维蛋原转变为纤维蛋白，这些纤维蛋白就能聚集成疏松的栓子来封闭伤口，实现快速止血的效果。同时，在体内它并不激活凝血因子xm，由其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交联，易被纤维蛋白溶酶降解，所以不会造成血液系统的栓塞。巴曲酶现已经被成功地开发成止血药——进口的有立止血(Reptilase)，国产的有巴曲亭，在临床上具有很好的止血效果。成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白，其氨基酸序列如下1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEWVLTAA41HCNRRFMRIHLGKHAGSVANYDEWRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGWGAITTSEDTYPDWHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVLQGGIDTCGGDSGGPLICNGQFQGILSWGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPWIQSIIAGNKTATCP其DNA序列如下1GTCATTGGAGGTGATGMTGTGACAT雄TGMCATCCTTTCCTTGCATTCATGTACTAC61TCTCCCCGGTATTTCTGTGGTATGACTTTGATCMCCAGGAATGGGTGCTGACCGCTGCA121CACTGTAACAGGAGATTTATGCGCATACACCTTGGT嵐CATGCCGGAAGTGTAGC嵐T181TATGATGAGGTGGTMGATACCCAAAGGAGMGTTCATTTGTCCCMTMGAAAAAAMT241GTCATMCGGACMGGACATTATGTTGATCAGGCTGGACAGACCTGTCMAMCAGTGM301CACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCMCCCTCCCAGTGTGGGCTCAGTTTGCCGTATT361ATGGGATGGGGCGCMTCACAACTTCTGMGACACTTATCCCGATGTCCCTCATTGTGCT421AACATTAACCTGTTCMTMTACGGTGTGTCGTGMGCTTACAATGGGTTGCCGGCG嵐481ACATTGTGTGCAGGTGTCCTGCAAGGAGGCATAGATACATGTGGGGGTGACTCTGGGGGA541CCCCTCATCTGTAATGGACAATTCCAGGGCATTTTATCTTGGGGAAGTGATCCCTGTGCC601GMCCGCGTAAGCCTGCCTTCTACACCMGGTCTTTGATTATCTTCCCTGGATCCAGAGC661ATTATTGCAGGAMTAAAACTGCGACTTGCCCG理论计算出其分子量为25.5KD,等电点为7.39，国外从5o决ra/w^m毒液中提取的巴曲酶，其实际分子量为42KD，这种分子量的偏差是由于糖基化修饰的缘故。从巴曲酶蛋白质一级结构中可以发现，其分子内有两个N-糖基化位点Asn"、Asn"-Thr"s和Asn^Lys气Thr228。此外，5o决ro，a/rnx的其他亚种以及其他种类毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不过其分子量从29.1KD到42KD不等，这可能是由于不同亚种之间氨基酸组成上差别或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12个半胱氨酸，根据己知的丝氨酸蛋白酶类分子的研究结果，推测这12个半胱氨酸可能有Cys:Cys139、Cys26-CyS42、CyS74-Cys23G、Cys118-Cys184、Cys15。-CyS168、Cys174-Cys199六个分子内二硫键的形成(Itohn.etal.TheJ.ofBiologicalChemistry,262,3132,1987)。考虑到从巴西进口蛇毒原料成本较高，同时，巴西矛头蝮蛇是稀有的保护蛇种，蛇毒产量有限。因此，我们设想采用基因工程的方法大量生产重组巴曲酶，我们首先构建了表达天然巴曲酶的基因工程菌种，但发现在发酵表达时，目的蛋白有严重的降解现象，这就极大地影响了巴曲酶的产量。因此，我们想对巴曲酶进行定点突变，将巴曲酶基因上KEX2蛋白酶的酶切位点进行突变，避免其对发酵液中所表达的巴曲酶的降解，同时还不影响巴曲酶的凝血活性，这将极大地提高巴曲酶的产量，更好地满足研究和临床应用的需要。巴曲酶蛋白虽然只有一条肽链，但是由于分子内二硫键多，还有糖基化修饰等，所以采用基因工程手段生产这种蛋白有很大的技术难度。这也应该是一直没有重组产品问世的主要原因之一。虽然研究者对天然巴曲酶的性质有比较多的了解，但是，对其分子生物学方面的研究一直进展缓慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成对巴曲酶基因的cDNA和基因组DNA测序工作(NobuyukiItohetalJ.Biol.Chem.262(7):3132-3135，1987;J.Biol.Chem.,263:7628-7631,1988)。MaedaM等采用基因重组方法，在E.coli中，采用融合表达系统，以包涵体(InclusionBody)的形式表达出该成份，据报道得到了所谓有生物学活性巴曲酶(MaedaM.etal，JBiochem(Tokyo)，109(4):632-637，1991)，而且还为此申请了专利(Pat，No.:JP2124092，1990)。在中表达某些蛋白已经是较为常规的生产药用蛋白的基本手段，但是在对蛇毒类凝血酶实际研究中发现，在Eco//中表达蛇毒类凝血酶的量很少。潘华等采用RT-PCR法扩增出蝮蛇"gHs/rodo"/w/"户a/Zos)蛇毒类凝血酶基因Pallas，以表达载体pET-24a(+)构建T-7启动子控制下的表达质粒pET-Pallas，转化E.coliBL21(DE3)，并用0.4mmol/LIPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的Pallas表达(潘华等，蝮蛇类凝血酶基因的分析及表达研究，生物化学与生物物理学报，1999，31，79)。Fan等采用PCR法扩增出蝮蛇C4g/b'欣oJow"cwft^)的蛇毒类凝血酶基因Acutin，克隆到表达载体pET-24a，在￡.co//BL21DE(3)中表达，经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的Acutin表达(FanCY.等,BiochemistryandMolecularBiologyInternational,1999，47，217)。但它们的表达效率普遍较低，没有实际生产价值。杨青等报道了用甲醇酵母表达Gussurobin,获得每升发酵液产10mg有活性的Gussurobin(杨青等，BiotechnologyLetters,2002，24，135);Weon-KyooYou等报道了用甲醇酵母表达Batroxobin，获得了每升发酵液产13.16mg有活性的Batroxobin(Weon-KyooYou等，FEBSLetters，2004，571,67)。上海万兴生物制药有限公司申请了基因工程表达Batroxobin的专利(公开号CN1534093A，2004)，在大肠杆菌和甲醇酵母中均获得表达，但在大肠杆菌中表达的Batroxobin均为无活性蛋白。在甲醇酵母中获得一定量Batroxobin的表达，产量达每毫升发酵液20克氏单位(20KU/ml)，这一产量已初步具备生产意义。上述研究结果表明利用基因工程方法生产蛇毒类凝血酶是可行的，但要用真核表达系统。到目前为止，Batroxobin的基因工程产品还没有上市。采用基因工程的手段生产富含多对二硫键的蛋白一直是一个技术难题，尤其是生产有六对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶。这是因为二硫键配对错误率很高，在原核中得到的几乎全是包涵体，虽然对包涵体的变性复性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本决定了不具备实际生产意义。真核表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)能保证较高的二硫键配对正确率。另外，蛇毒类凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核细胞不能对所表达的外原蛋白进行糖基化，而糖基对蛋白的空间结构和酶活性都起稳定作用。因此空间结构复杂、有糖链的蛋白本身就不适合用原核细胞进行表达。而真核表达系统除能保证较高的二硫键配对正确率外，还能对表达产物进行一定程度的糖基化，虽然糖基化的含量和种类与蛇毒中类凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保证了表达产物的活性。
发明内容本发明的目的在于提供一种定点突变的基因工程巴曲酶，它能够通过以分泌表达的方式大量生产获得，同时具有较高的生物活性。本发明提供了一种定点突变的基因工程巴曲酶，能使含抗凝剂的动物血浆凝固，其特征在于所述定点突变的基因工程巴曲酶氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突变为Lys，具体为1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEWVLTAA41HCNI^FMRIHLGKHAGSVANYDEWRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGWGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVL(JGGIDTCGGDSGGPLICNGQFQGILSWGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPWIQSIIAGNKTATCP本发明具有生物活性的定点突变的基因工程巴曲酶，可以通过将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生获得。优选地，本发明定点突变的基因工程巴曲酶可以通过甲醇酵母菌以分泌表达的方式大量产生获得。在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，可以依据巴曲酶的天然氨基酸序列，选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子，人工合成定点突变的巴曲酶结构基因序列，再将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因重组到甲醇酵母菌表达载体/7尸/C9尺和；尸/CZff中。其中人工合成定点突变的巴曲酶结构基因序列最好为1GTTATTGGTGGTGATGAATGTGATATTAACGAACATCCATTTTTGGCTTT51TATGTACTACTCTCCAAGATACTTTTGTGGTATGACTTTGATTAACCAAG101AATGGGTTTTGACTGCTGCTCATTGTAACAGAM^TTTATGAGAATTCAT151TTGGGTAAGCATGCTGGTTCTGTTGCTAACTACGATGAAGTTGTTAGATA201CCCAAAGGAAAAGTTTATTTGTCCAAACAAGAAGAAGAACGTTATTACTG251ATAAGGATATTATGTTGATTAGATTGGATAGACCAGTTAAGAACTCTGAA301CATATTGCTCCATTGTCTTTGCCATCTAACCCACCATCTGTTGGTTCTGT351TTGTAGAATTATGGGTTGGGGTGCTATTACTACTTCTGAAGATACTTACC401CAGATGTTCCACATTGTGCTAACATTAACTTGTTTAACAACACTGTTTGT451AGAGAAGCTTACAACGGTTTGCCAGCTAAGACTTTGTGTGCTGGTGTTTT501GCAAGGTGGTATTGATACTTGTGGTGGTGATTCTGGTGGTCCATTGATTT551GTAACGGTCAATTTCAAGGTATTTTGTCTTGGGGTTCTGATCCATGTGCT601GAACCAAGAAAGCCAGCTTTTTACACTAAGGTTTTTGATTACTTGCCATG651GATTCAATCTATTATTGCTGGTAACAAGACTGCTACTTGTCCA在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，可以利用酵母菌的a-信号肽，PHOl信号肽，或者利用巴曲酶的天然信号肽将巴曲酶移出细胞，其中在信号肽序列与巴曲酶蛋白序列之间插入KEX2蛋白酶识别序列AAAAGA。本发明定点突变的基因工程巴曲酶，可作为止血药的主要成份，也可以直接作为止血药之用。本发明对巴曲酶进行定点改造。核酸序列按酵母菌喜好的遗传密码子，将编码第45位氨基酸的AGA(精氨酸)突变为AAG(赖氨酸)，人工合成定点改造的巴曲酶结构基因序列，除定点突变外均为同义突变，即并没改变氨基酸种类。本发明定点突变的意义就在于，通过定点突变，使巴曲酶分子中的KEX2酶切位点Arg-Arg突变为Aig-Lys，使酵母菌产生的KEX2酶不能对酵母所表达的目的产物巴曲酶进行酶解，从而大大地提高了巴曲酶的产量，并且这种突变并不影响巴曲酶的凝血活性。目前，在国内外还未见对巴曲酶进行定点改造的研究报道。将人工合成定点改造的巴曲酶的结构基因重组到酵母菌表达载体pPIC9K和pPICZc中，在酵母菌中实现分泌表达。通过优化发酵条件，确定了酵母菌最优发酵表达条件，并对表达产物进行了分离纯化，得到了高活性的定点突变基因工程巴曲酶。结果表明，定点突变基因工程巴曲酶较从蛇毒中提取的天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。产率达58KU/ml发酵液。比没有突变的基因工程巴曲酶的产量提高了近l倍。具体实施例方式实施例1根据美国Genebank中公开的巴曲酶(X12747)的核酸序列，选择酵母菌喜好的遗传密码子，人工合成巴曲酶的定点改造的结构基因序列，将编码第45位的Aib的密码AGA突变为编码Lys的AAG，将酵母菌内源KEX2蛋白酶识别序列Arg-Arg突变为Aig-Lys,因此KEX2蛋白酶就不会在此位点降解分泌到发酵液中的巴曲酶，从而使目的蛋白能够大量积累。为使合成的目的基因重组到酵母菌分泌型表达载体pPICZff中，在基因的5'端添加XhoI酶切位点、基因的3'端添加终止密码子TAATGA及SacII酶切位点。另外，在XhoI酶切位点与巴曲酶蛋白N-端第一个氨基酸Val密码子之间加入KEX2蛋白酶识别序列Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，这就确保了目的蛋白在分泌到发酵液中时能够顺利地切除"-信号肽。将合成的目的基因及pPICZ"载体经XhoI和SacII双酶切，电泳、回收，将目的基因重组到pPICZ"中，转化到大肠杆菌ToplOF'中，进行筛选。转化有pPICZ"的大肠杆菌ToplOF，在LB+25ug/mgZeocin的平板上的进行培养，挑取单菌落，在液体培养基中培养，提取质粒，XhoI和SacII双酶切检测或进行a-factorpriming和3'AOX1primingPCR检测，说明pPICZ"中含有目的基因，可以用来转化尸&似"X-33，KM71H或GS115宿主菌。实施例2用DNA限制性内切酶Sacl将pPICZa-Bg线性化，按照Invitrogen公司Multi-Copy尸fc/7/aExpressionKitVersionB中的方法制备酵母宿主感受态并进行转化，将转化后的细胞涂在YPD+500ug/mlZeocin培养基上生长，30'C下放置3-4天可出现单菌落。挑选菌落大而饱满的克隆进行表达筛选。实施例3用在试管中筛选出的高表达的工程菌，接种到摇瓶中增殖作为种子液，再转接至10L发酵罐，按甲醇酵母发酵的常规方法进行中试规模的发酵。诱导72小时。将发酵液离心收集上清，或超滤浓縮脱盐，采用疏水柱层析、离子交换柱层析、亲和柱层析、凝胶柱层析等生化分离技术，得到纯度达97%以上的活性蛋白。采用同类产品活性的测定方法进行体外凝血试验，具体实验方法为取人一枸橼酸抗凝血浆0.2ml，加入直径lcm的试管中，置37。C水浴中保温3分钟，加入37。(:预热的样品溶液0.21111，立即混匀计时，于40秒开始，检査血浆凝固情况，记录初凝时间，同时测定3管，3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒，则适当稀释供试品溶液，记录60土20秒内凝固的供试品溶液浓度，在上述条件下，能使0.2ml人一枸橼酸抗凝血浆在60秒凝固的酶量，定义为一个单位。实施例4种子液在2L酵母氮源基础培养基中28'C发酵24小时后转到40L发酵液中进行发酵培养。培养基H3P04，27ml/L;CaS042H2O，0.9g/L;K2SO418g/L;MgSO47H20，15g/L;KOH，4.13g/L;甘油40g/L;4.4ml/L微量矿物质溶液。在发酵过程中，用NH40H调pH值，使其维持在6.0。3(TC通氧剧烈搅拌(lOOOrpm)发酵，添加消泡剂。发酵24小时后，加入含12ml/L微量矿物质的50%甘油，溶氧浓度为40%，继续培养10小时。当碳原饥饿30分钟后，加入甲醇诱导。刚开始的5小时加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母适应甲醇，100%甲醇含12ml/L微量矿物质溶液，其溶氧量在40%以上。继续发酵72小时，凝血活性达到58U/ml发酵液。实施例5对未经定点突变的基因工程巴曲酶进行发酵表达，两菌种除突变点外,其它遗传背景完全相同，按照实施例4的发酵条件进行发酵，凝血活性达到30KU/ml发酵液。实施例6发酵液离心，收集上清液，加入(NH4)2S04使其浓度达到1.6mol/L，然后加到phenyl-S印harose层析柱上，用(NH4)2S04从1.6~0mol/L进行梯度洗脱，收集活性峰，然后上亲和柱benzamidine-SepharoseCL-6B，50mMTris/HCl,pH8.2，洗脱液含0.5MNaCl，收集活性峰。接着上SephadexG-50，流动相50mMTris/HCl，pH8.2,含0.5MNaCl,收集活性峰。最后，SephadexG-25脱盐，收集活性峰。冻干，存于-2(TC。SDS-PAGE电泳检测纯度达97%以上。送样品测定氨基酸序列，结果同理论设计的完全一致。见定点突变后的batroxobin氨基酸序列。实施例7发酵液离心，收集上清液，用65%固体,)2804使活性蛋白盐析低温过夜，离心，收集沉淀，溶于50mmol/LTris-HCl，pH8.2，并透析，离心，取上清上亲和柱benzamidine-S印haroseCL-4B，用含0.5mol/LNaCl的上述缓冲液进行洗脱，收集活性峰。用50mmol/LTris-HCl,pH8.2缓冲液稀释，上阴离子交换柱MonoQ，用含0.5mol/LNaCl上述缓冲液进行洗脱，收集活性峰，最后，上用相同缓冲液平衡好的SephacrylS-200柱，收集活性峰。SDS-PAGE电泳检测纯度达97。/。以上。冻干，存于-20。C。实施例7按照临床研究指导原则，体内凝血试验采用小鼠断尾法。结合巴曲酶临床用量情况，小鼠用药剂量按人的用药剂量作相应的调整，选择中等用药浓度lu/kg。取健康小鼠，随机分为7组，每组5只，小鼠尾静脉注射0.5ml,并于注射后15分钟时，用剪刀在距小鼠尾尖0,3cm处剪断，血液自行流出后立即计时，到血液凝固停止计时。以出血时间縮短作为判断止血效果的指标。同时用生理盐水作为阴性对照，用从蛇毒中提取的巴曲亭做阳性对照。结果见下表表1类凝血酶(巴曲酶)体内凝血试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果:用药组小鼠剪尾出血时间与阴性对照组相比均有不同程度的縮短(33.8%43.0%)。其中突变和未突变的重组巴曲酶的止血时间短于蛇毒中提取的巴曲酶，但差别不是很显著。权利要求1、一种定点突变的基因工程巴曲酶，能使含抗凝剂的动物血浆凝固，其特征在于所述定点突变的基因工程巴曲酶的氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突变为Lys，具体为1VIGGDECDINEHPFLAFMYYSPRYFCGMTLINQEWVLTAA41HCNRKFMRIHLGKHAGSVANYDEVVRYPKEKFICPNKKKN81VITDKDIMLIRLDIPVKNSEHIAPLSLPSNPPSVGSVCRI121MGWGAITTSEDTYPDVPHCANINLFNNTVCREAYNGLPAK161TLCAGVLQGGIDTCGGDSGGPLICNGQFQGILSWGSDPCA201EPRKPAFYTKVFDYLPWIQSIIAGNKTATCP2、按照权利要求l所述定点突变的基因工程巴曲酶，其特征在于所述具有生物活性的定点突变的基因工程巴曲酶，通过将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生获得。3、按照权利要求2所述定点突变的基因工程巴曲酶，其特征在于所述酵母菌为甲醇酵母菌。4、按照权利要求3所述定点突变的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，依据巴曲酶的天然氨基酸序列，选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子，人工合成定点突变的巴曲酶结构基因序列。5、按照权利要求4所述定点突变的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因插入到甲醇酵母菌表达载体;iva^:或p户/cz"中。6、按照权利要求4或5所述定点突变的基因工程巴曲酶，其特征在于所述人工合成定点突变的巴曲酶结构基因序列为1GTTATTGGTGGTGATGAATGTGATATTAACGAACATCCATTTTTGGCTTT51TATGTACTACTCTCCAAGATACTTTTGTGGTATGACTTTGATTAACCAAG101AATGGGTTTTGACTGCTGCTCATTGTAACAGAAAGTTTATGAGAATTCAT151TTGGGTAAGCATGCTGGTTCTGTTGCTAACTACGATGAAGTTGTTAGATA201CCCAAAGGAAAAGTTTATTTGTCCAAACAAGAAGAAGAACGTTATTACTG251ATAAGGATATTATGTTGATTAGATTGGATAGACCAGTTAAGAACTCTGAA301CATATTGCTCCATTGTCTTTGCCATCTAACCCACCATCTGTTGGTTCTGT351TTGTAGAATTATGGGTTGGGGTGCTATTACTACTTCTGAAGATACTTACC401CAGATGTTCCACATTGTGCTAACATTAACTTGTTTAACAACACTGTTTGT451AGAGAAGCTTACAACGGTTTGCCAGCTAAGACTTTGTGTGCTGGTGTTTT501GCAAGGTGGTATTGATACTTGTGGTGGTGATTCTGGTGGTCCATTGATTT551GTAACGGTCAATTTCAAGGTATTTTGTCTTGGGGTTCTGATCCATGTGCT601GAACCAAGAAAGCCAGCTTTTTACACTAAGGTTTTTGATTACTTGCCATG651GATTCAATCTATTATTGCTGGTAACAAGACTGCTACTTGTCCA7、按照权利要求3所述定点突变的基因工程巴曲酶，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，利用酵母菌的a-信号肽，PHOl信号肽，或者利用巴曲酶的天然信号肽将巴曲酶移出细胞，其中在信号肽序列与巴曲酶蛋白序列之间插入KEX2蛋白酶识别序列。8、权利要求17之一所述定点突变的基因工程巴曲酶在制造止血药物方面的用途。全文摘要一种定点突变的基因工程巴曲酶，能使含抗凝剂的动物血浆凝固，其特征在于所述定点突变的基因工程巴曲酶氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突变为Lys。本发明能够通过以分泌表达的方式大量生产具有较高的生物活性的定点突变基因工程巴曲酶。文档编号C12N9/50GK101319207SQ20071001156公开日2008年12月10日申请日期2007年6月6日优先权日2007年6月6日发明者兰海英,梅徐,英李,沈文彧,王宏英,珊苏,雁薛,薛百忠,欣高申请人:沈阳守正生物技术有限公司