专利名称:一种以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法
技术领域：
本发明涉及甲醇酵母表达抗血栓药物重组巴曲酶的发酵工艺。背景技术：
随着血栓栓塞性疾病患者的增加，抗血栓药物的研制已成为热点之一。人们一方面采用分子生物学技术对现有药物进行分子结构改造，以期获得更为优良的溶栓药物。另一方面，积极的寻找一些安全性好、疗效好、副作用小的天然来源的溶栓药物。
在E.coli中表达某些蛋白已经是较为常规的生产药用蛋白的基本手段，但是在对蛇毒类凝血酶实际研究中发现，在E. coli中表达蛇毒类凝血酶的量很少。潘华等采用 RT-PCR法扩增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶基因I^allas，以表达载 #pET-24a(+)构建T-7启动子控制下的表达质粒pET-Pallas，转化E. coli BL21(DE3), 并用0. 4mmol/L IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的 I^llas表达(潘华等，蝮蛇类凝血酶基因的分析及表达研究，生物化学与生物物理学报， 1999，31，79)。Fan等采用PCR法扩增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒类凝血酶基因 Acutin，克隆到表达载体pET-Ma，在E. coli BL21DE(3)中表达，经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的Acutin表达(Fan C. Y.等，Biochemistry and Molecular Biology International, 1999，47，217)。但它们的表达效率普遍较低，没有实际生产价值。
采用基因工程的手段生产富含多对二硫键的蛋白一直是一个技术难题，尤其是生产有六对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶。这是因为二硫键配对错误率很高，在原核中得到的几乎全是包涵体，虽然对包涵体的变性复性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本决定了不具备实际生产意义。真核表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)能保证较高的二硫键配对正确率。另外，蛇毒类凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核细胞不能对所表达的外原蛋白进行糖基化，而糖基对蛋白的空间结构和酶活性都起稳定作用。因此空间结构复杂、有糖链的蛋白本身就不适合用原核细胞进行表达。而真核表达系统除能保证较高的二硫键配对正确率外，还能对表达产物进行一定程度的糖基化，虽然糖基化的含量和种类与蛇毒中类凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保证了表达产物的活性。
蛇毒类凝血酶现已广泛应用于临床并取得明显的临床效果，但仍有很多问题未解决一是蛇毒类凝血酶制剂作为一种生物制品，存在抗原性，偶有过敏反应出现，且多次应用后易产生相应的抗体，从而降低制剂的疗效；二是蛇毒的来源有限，不利于大规模生产， 同时价格较高，不利于其广泛应用；三是类凝血酶是从蛇毒中纯化得到的，纯度难以控制， 从而增加了毒副作用。解决这些问题的办法是借助基因重组技术，在实验室中进行表达，但这些必须在对蛇毒类凝血酶的结构及性质作更深入的研究后方可进行。
成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白，理论计算出其分子量为25. 5KD，等电点为7.39，国外从Bothrops atrox毒液中提取的巴曲酶，其实际分子量为42KD，这种分子量的偏差是由于糖基化修饰的缘故。从巴曲酶蛋白质一级结构中可以发现，其分子内有两个N-糖基化位点=Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr^此外，Bothrops atrox的其他亚种以及其他种类毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不过其分子量从29. IKD到42KD不等，这可能是由于不同亚种之间氨基酸组成上差别或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12个半胱氨酸，根据已知的丝氨酸蛋白酶类分子的研究结果，推测这12个半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42, Cys74-Cys230, CyS118-Cys184、CyS15°-CyS163、CySm-CyS199六个分子内二硫键的形成(Itoh n. et al. The J. of BiologicalChemistry,262，3132，1987)。
考虑到进口蛇毒原料成本较高，同时，巴西矛头蝮蛇是稀有的保护蛇种，蛇毒产量有限。因此，我们采用基因工程的方法大量生产重组巴曲酶，我们首先构建了表达天然巴曲酶的基因工程菌种，但发现在发酵表达时，目的蛋白有严重的降解现象，这就极大地影响了巴曲酶的产量。
因此，我们对巴曲酶进行定点突变，将巴曲酶基因上KEX2蛋白酶的酶切位点进行突变，避免其对发酵液中所表达的巴曲酶的降解，同时还不影响巴曲酶的凝血活性，这将极大地提高巴曲酶的产量，更好地满足研究和临床应用的需要。
巴曲酶蛋白虽然只有一条肽链，但是由于分子内二硫键多，还有糖基化修饰等，所以采用基因工程手段生产这种蛋白有很大的技术难度。这也是一直没有重组产品问世的主要原因之一。
虽然研究者对天然巴曲酶的性质有比较多的了解，但是，对其分子生物学方面的研究一直进展缓慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成对巴曲酶基因的CDNA和基因组 DNA 测序工作(Nobuyuki Itoh etal J. Biol. Chem. 262(7) :3132-3135,1987 J. Biol. Chem. ,263 :7628-7631,1988) MaedaM等采用基因重组方法，在Ε. coli中，采用融合表达系统，以包涵体(InclusionBody)的形式表达出该成份，据报道得到了所谓有生物学活性巴曲酶(MaedaM. etal, J Biochem(Tokyo)，109(4) :632-637,1991)，而且还为此申请了专利 (Pat, No. :JP2124092，1990)。但没有后续报道。
采用基因工程的手段生产富含多对二硫键的蛋白一直是一个技术难题，尤其是生产有六对二硫键的丝氨酸蛋白水解酶。这是因为二硫键配对错误率很高，在原核中得到的几乎全是包涵体，虽然对包涵体的变性复性能得到少量的有活性的目的蛋白，但是其成本决定了不具备实际生产意义。真核表达系统(酵母、CHO和昆虫细胞等)能保证较高的二硫键配对正确率。另外，蛇毒类凝血酶分子中有不同含量的糖基化，原核细胞不能对所表达的外原蛋白进行糖基化，而糖基对蛋白的空间结构和酶活性都起稳定作用。因此空间结构复杂、有糖链的蛋白本身就不适合用原核细胞进行表达。而真核表达系统除能保证较高的二硫键配对正确率外，还能对表达产物进行一定程度的糖基化，虽然糖基化的含量和种类与蛇毒中类凝血酶分子所含的糖基不同，但也很好地保证了表达产物的活性。
Weon-Kyoo You等报道了用甲醇酵母表达Batroxobin，获得了每升发酵液产 13. 16mg 有活性的 Batroxobin (Weon-Kyoo You 等，FEBS Letters，2004，571，67)。
上海万兴生物制药有限公司申请了基因工程表达Batroxobin的专利(公开号CN1534093A，2004)，在大肠杆菌和甲醇酵母中均获得表达，但在大肠杆菌中表达的 Batroxobin均为无活性蛋白。在甲醇酵母中获得一定量Batroxobin的表达，产量达每毫升发酵液20克氏单位(20KU/ml)，这一产量已初步具备生产意义。上述研究结果表明利用基因工程方法生产蛇毒类凝血酶是可行的，但要用真核表达系统。[0014]本公司也申请了相关专利，申请号200710011566.4(—种定点突变的基因工程巴曲酶及用途)，产量达每毫升发酵液90克氏单位。可完全用于抗血栓药物的生产开发。
发明内容
本发明是对定点突变巴曲酶的高密度连续发酵工艺的研究，其目的在于提供一种抗血栓的重组巴曲酶的发酵方法，研究结果表明，该方法可大幅提高发酵效率，使目的产物的表达量得到显著提高。
本发明具体提供了一种以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法，包括酵母菌的分批发酵、补料发酵及甲醇诱导表达巴曲酶阶段，所述酵母菌是相对于天然的巴曲酶的第45 位精氨酸突变为赖氨酸的重组定点突变巴曲酶，具体为
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本发明提供的一种以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法，其特征在于，酵母菌的分批发酵、补料发酵的碳源为甘油，PH = 5. 0-5. 5 ；甲醇诱导表达巴曲酶阶段的pH = 6. 8-7. 0，温度为25°C，甲醇浓度为0. 5%。进行甘油和甲醇混合补料诱导和表达时，其诱导时菌体OD高于300，诱导阶段维持3小时士0. 5小时，菌体高密度表达，最高达到0D600。当菌体活性不再增长时，进行放料补料，开始连续培养；其中补料为盐培养基。放料补料后，OD 值应保持在300-350之间。
本发明所述重组定点突变巴曲酶能够通过以分泌表达的方式大量生产获得，同时具有较高的生物活性。它可以通过将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因在酵母菌细胞中，以分泌表达的方式大量产生获得，优选通过甲醇酵母菌以分泌表达的方式大量产生获得。
本发明所述重组定点突变巴曲酶，在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，可以依据巴曲酶的天然氨基酸序列，选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子，人工合成定点突变的巴曲酶结构基因序列，再将人工合成的定点突变的巴曲酶结构基因重组到甲醇酵母菌表达载体 pPICZa中。并转化到KM7IH酵母菌种。
通过优化发酵条件，确定了酵母菌最优发酵表达条件，并对表达产物进行了分离纯化，得到了高活性的重组定点突变巴曲酶。结果表明，定点突变基因工程巴曲酶较从蛇毒中提取的天然巴曲酶的比活性提高了一倍多。产率达到每毫升发酵液高于90KU。
具体实施方式
实施例1
挑YPD平板培养基30°C培养的单菌落于摇瓶中进行震荡培养18小时，然后转接到 1. 5升继续培养过夜，直接接种到30升发酵罐中，培养基15升为盐培养基，溶氧保存30 %， 转数700-800rpm。碳源耗尽后进行甘油流加补料。[0029]在OD值达到300-350时，进入甲醇诱导阶段，在2小时的时间内甲醇加到0. 2%。 当甲醇开始利用时，甲醇浓度逐渐提高到0. 5% 1%，并逐渐降低培养温度到25°C，pH调至6. 8 7. 0，发酵过程中要维持罐压在0. 04-0. 06MPa之间，空气流量在0. 2-0. 25VVM之间，转速维持在700 800rpm之间。
当OD接近600，活性达90U时，进行放料、补料，放料补料后，OD值应在300-350左
右。培养基装量为15L左右，然后进行连续培养。通过连续培养，每批产量都可大幅提高， 放料补料次数越多，产量越高。按照放料补料一次，可提高70%左右，达到4. OX 106KU。
采用同类产品活性的测定方法进行体外凝血试验，具体实验方法为取人一枸橼酸抗凝血浆0. anl，加入直径Icm的试管中，置37°C水浴中保温3分钟，加入37°C预热的样品溶液0. anl，立即混勻计时，于40秒开始，检查血浆凝固情况，记录初凝时间，同时测定3 管，3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒，则适当稀释供试品溶液，记录 60士20秒内凝固的供试品溶液浓度，在上述条件下，能使0. 2ml人-枸橼酸抗凝血浆在60 秒凝固的酶量，定义为一个KU。
实施例2
挑YPD平板培养基30°C培养的单菌落于摇瓶中进行震荡培养18小时，然后转接到
1.5升继续培养过夜，直接接种到30升发酵罐中，培养基15升为盐培养基，溶氧保存30 %， 转数700-800rpm。碳源耗尽后进行甘油流加补料。
按invitrogin的发酵方法进行中试规模的发酵。其它诱导200小时以上。当发酵液中蛋白活性不再增加时，将发酵液离心收集上清，蛋白活性达到90KU/ml，产量达到
2.34X 106KU。经微滤除菌，采用疏水柱层析、离子交换柱层析、凝胶柱层析等生化分离技术，得到纯度达97%以上的活性蛋白。
实施例3
种子液在1. 5L酵母氮源基础培养基中发酵M小时后，转到30L发酵液中进行发酵培养。13. 5L 盐培养基，组成如下=H3PO4, 27ml/L ；CaSO4 · 2H20,0. 9g/L ；K2SO4,18g/ L ；MgSO4 · 7H20,15g/L ；Κ0Η，4· 13g/L ；甘油 40g/L ；4. 4ml/L 微量矿物质溶液。
在发酵过程中，用NH4OH调pH值，使其维持在5. 0。30°C通氧剧烈搅拌(IOOOrpm) 发酵，添加消泡剂。发酵M小时后，加入含12ml/L微量矿物质的50%甘油，溶氧浓度为 30%，继续培养10小时。当碳原饥饿30分钟后，加入甲醇诱导。刚开始的5小时加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母适应甲醇，100%甲醇含12ml/L微量矿物质溶液，其溶氧量在30%以上。继续发酵活性不再增加，凝血活性达到43KU/ml，产量达到1. 12X 106KU。
权利要求
1.一种以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法，包括酵母菌的分批发酵、补料发酵及甲醇诱导表达巴曲酶阶段，所述酵母菌是相对于天然的巴曲酶的第45位精氨酸突变为赖氨酸的重组定点突变巴曲酶，其特征在于酵母菌的分批发酵、补料发酵的碳源为甘油，PH =5. 0-5. 5 ；甲醇诱导表达巴曲酶阶段的pH = 6. 8-7. 0，温度为25°C，甲醇浓度为0. 5%。
2.按照权利要求
1所述以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法，其特征在于，进行甘油和甲醇混合补料诱导和表达，其诱导时菌体OD高于300，诱导阶段维持3小时士0. 5小时，菌体高密度表达，最高达到0D600。
3.按照权利要求
1所述以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法，其特征在于，当菌体活性不再增长时，进行放料补料，开始连续培养；放料补料后，OD值应保持在300-350之间。
4.按照权利要求
3所述以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法，其特征在于，所述补料为盐培养基。
专利摘要
本发明的目的在于提供一种以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法，包括酵母菌的分批发酵、补料发酵及甲醇诱导表达巴曲酶阶段，所述酵母菌是相对于天然的巴曲酶的第45位精氨酸突变为赖氨酸的重组定点突变巴曲酶，其特征在于，酵母菌的分批发酵、补料发酵的碳源为甘油，pH＝5.0-5.5；甲醇诱导表达巴曲酶阶段的pH＝6.8-7.0，温度为25℃，甲醇浓度为0.5％。研究结果表明，该方法可大幅提高发酵效率，使目的产物的表达量得到显著提高。
文档编号C12N9/60GKCN102242101SQ201010166684
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月10日
发明者姜大威, 孟威, 徐梅, 杨宇, 王宏英, 王建华, 薛百忠, 薛雁 申请人:辽宁诺康医药有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan