专利名称:一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒，特别是涉及一种利用多重不对称扩增及反向点杂交技术检测α、β地中海贫血突变型的试剂盒，该试剂盒包含一套特异性核苷酸多态性探针和扩增样品中靶基因的PCR引物，可同时检测由于点突变引起的α、β地中海贫血，将广泛应用于地中海贫血的检测及优生优育指导。
背景技术：
地中海贫血分为α、β、δ、δβ、Υδβ等几种类型，常见的为α地中海贫血 (简称α地贫)和β地中海贫血(简称β地贫)，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一，也是世界上最常见的遗传性疾病之一。据WHO统计全世界约有1. 5亿多人携带地贫基因。在我国的广东、广西、海南、香港、湖南、湖北、云南、贵州、四川等地区常见，黄河以南至长江流域，台湾、福建及西藏等省(区)均有病例报道；患者以汉族多见，亦可见于回、傣、壮、苗和布衣等少数民族，海南黎族地贫基因突变的发生率达58.4%。抽样调查发现，广西“地贫”基因携带者高达20%，居全国之首，广东为12%，居第二位，四川、重庆等省市也是高发区，有报导发病率在4 7%。
α地贫是一种由于α-珠蛋白(a-Globin)基因突变导致α-珠蛋白合成减少， α-链/非 α-链比例失衡而产生的单基因遗传性溶血性血红蛋白病。分缺失型和突变型 (非缺失型突变)两类，突变型α-地贫是指用限制性内切酶图谱法未能检测出明显的基因缺失，但在其中可能包括导致基因功能丧失的小片段核苷酸的缺失，插入或碱基替代。非缺失型α-地贫的突变大多位于功能较强的α2珠蛋白基因，故非缺失型血红蛋白H病患者的临床表现要比缺失型血红蛋白H病患者的临床表现更为严重。目前世界上已报道了至少46种引起非缺失型α -地贫的点突变，这些突变影响mRNA加工，mRNA的翻译及翻译后肽链不稳定或肽链缩短，导致α-珠蛋白链合成减少从而引起α地中海贫血。中国人群中目前已报道了 α aCD30、α α 31、α α 59、α α cs、α α QS、α α丽6种α地贫突变类型。我国最常见最早鉴定的是α α es、α α QS。α α QS是α 2基因第125密码子CTG(亮氨酸)突变为CCG (脯氨酸)，是一种高度不稳定的α -珠蛋白，阻碍α 1 β 1 二聚体的形成，从而影响四聚体的合成；而α aes是α 2基因终止密码突变，使α链延长为172个氨基酸。这种突变基因转录的mRNA不稳定，导致α链障碍。
β地贫是一种由β珠蛋白(β-Globin)基因异常导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由珠蛋白基因点突变所致。目前在中国发现的突变类型有27种，最常见的突变有 CD41/42(41. 6% )、IVSII-654(21. 8% )、CD17(18. 0% )、TATA 28(8. 0% )、 CD71/72(3. 9% ),TATA 29(1. 2% )等，其它突变类型(5. 5% )
目前用于单独检测α突变型地贫均为科研试剂，可检测α α cs, α α QS、α α 三种突变型别，而在中国人群中也有报道的α am3°、α α CD3/ α α GD59三种型别没有纳入检测范围。检测β突变型地贫目前存在商品化的试剂盒，但最多仅能够检测其中的17 种，对于一些少数民族地区和新近发现的突变无法检测，如新疆发现的⑶8(_ΑΑ)发生率
516.6% (李厚钧等，1994)，CD8/9(+G)(余伍忠等，1996)，广东发现的CD71/72(+T)(张力等，2008)，CD37(G —A)(钟惠珠等，2009)等。同时对于一些其它类别的突变，如IVSII_5、 41/42 (-TTCT)和IVSII-5(G — C)双重杂合子突变，目前商品化试剂盒也无法检测，仅有学者在做少量的统计学研究。
曲敬等公开了“用于诊断地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒”(公开号 CN 1718742Α)，该试剂盒仅检测中国的17种突变型别；杨梦苏公开了 “用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法”(公开号CN1453363A)可检测在中国发现的21种类型的突变。这两个专利难以实现商品化，是因为它们都存在共同的不足不能检测中国发现的27 种型别的突变，而且其探针设计需要通过大量的探针筛选才能得到比较满意的结果；均把 β-Globin基因扩增为两段，其中一段为600bp左右，而另一段为400bp左右。在杂交过程中，片段长度越长，杂交效率就越低，尤其是以玻片为载体的基因芯片，经验上的数值是不超过400bp，而为了弥补杂交效率不足，相应的措施是延长杂交时间，但这一措施并不适合于快速检测的初衷。
虽然β地贫突变检测试剂国内有数个厂家生产和销售，α突变型地贫也有一些科研试剂，但由于技术方法的局限，国内尚没有一次性完成检测的一体化试剂，往往要多个试剂盒多次检测才能完成，繁杂又耗资耗时，因此本发明开发一种一体化检测α、β地中海贫血核苷酸多态性的试剂盒。同时由于α地贫和β地贫少见突变型不仅是客观存在的， 而且可能由于缺乏有效的检测手段，没有深入研究而被忽略，为全面提高人口素质，有必要完善检测位点的覆盖率，因此该发明的试剂盒还具有高覆盖率的特点，可以检测6种α地贫点突变和27种β地贫突变，以满足临床应用的需求。
本发明的试剂盒以尼龙膜为基底的核酸杂交膜条技术，其主要的基本原理如下 寡核苷酸探针为含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端带有氨基标记。经活化处理的尼龙膜带有羧基，探针的氨基对羧基形成亲核攻击脱水后形成酰胺键从而将探针结合到膜上。PCR引物的5'末端带有生物素等标记基团，PCR反应结束后产物均带有生物素标记。
PCR产物与探针的结合过程可分为两个阶段，第一阶段在一定的温度下产物与探针互补配对结合，这一阶段的结合没有选择性，也就是说，只有部分互补配对也可以结合在探针上；第二阶段为特异性的洗脱阶段。第一阶段的非特异性结合中，当完全互补配对，则 PCR产物与探针的结合力强于部分结合，通过一定的温度和离子强度，将部分结合的PCR产物洗脱而完全互补配对的PCR产物因结合力强而不被洗脱。接下来通过辣根过氧化物酶结合于生物素基团，将PCR产物带上一个连接的辣根过氧化物酶，因辣根过氧化物酶在尼龙膜中存在物理吸附，需要用缓冲液将物理吸附的辣根过氧化物酶洗脱。最后一步为加入酶的底物，进行显色反应。
目前国内外基于膜杂交的商品化试剂均采用上述的原理，本发明在该技术平台的基础上，解决了杂交过程冗长的问题。同时在中国发现的6种α地贫突变型和27种类型的β地贫突变中，6种α地贫和17种β地贫为单碱基突变，且α珠蛋白基因GC含量极高，部分探针超过70%，导致Tm值较高，使探针在同一条件下完成杂交本身就是件难以做到的工作。因此，有必要探索更为有效的探针设计方法。郭学敏等公开了“一种寡核苷酸探针的设计方法”(公开号CN 1461811A)，该方法是在突变位点以外设计一个或多个人工突变，形成双突变或者多突变位点，但这样仍然无法有效的区分C — G后形成的G. G错配。本
6发明的试剂盒同时解决了这一技术难点。
本发明人通过反复的实验探索，成功开发了一种利用一种不对称扩增的方法一体化检测α、β地中海贫血核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒可以同时检测6种α地贫点突变和27种β地贫突变，检测过程更加快速，检测结果也更为准确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒，利用本试剂盒可以同时检测6种α地贫点突变和27种β地贫突变。
为了解决上述任务，本发的具体技术路线为
1)分别根据α -Globin和β -Globin基因序列设计PCR引物，设计的引物能够包括α-和β-地中海贫血全部突变位点。设计的引物可由专业的合成公司合成，如上海生工等。对上述引物的下游部分或上游和下游进行生物素或其它基团的标记，使得扩增的产物中含有相应的标记，以便在杂交后对杂交结果进行分析。
2)在包含所述引物的PCR试剂中，使用两管三重不对称PCR进行扩增，不对称PCR 的一个突出优势为PCR完成后，扩增产物中具有可与α-Globin和β-Globin基因突变探针特异性结合的DNA序列，可直接用于杂交实验而不需要通过热变性或者碱变性。PCR反应试剂涉及的组分可以使用市售的产品，如ΝΕΒ公司生产的Taq 5XMaster Mix, Fermentas 公司生产的热启动酶等。
3)根据α -Globin和β -Globin基因基因多态性的突变类型及相应的突变位点设计检测探针，设计的探针可以在正义链和/或反义链。设计的探针可由专业的合成公司合成，如上海生工等。
4)将上述探针点在经过活化的杂交膜上，加入扩增产物后，在杂交体系中，通过高浓度的盐离子溶液非选择性的结合靶基因，然后通过低浓度的盐离子浓度进行选择性的洗脱，再交联特异性结合的酶，最后加入酶的底物显色。
为了完成上述检测步骤，本发明提供的一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒由PCR试剂、低密度芯片、杂交试剂三部分组成。
根据本发明一个优选的实施方案，PCR试剂包括α-PCR管和β-PCR管，其中 α -PCR管由三对α -PCR引物、酶及PCR反应的其它常规组分组成，β -PCR管由三对β -PCR 引物、酶及PCR反应的其组分组成，其特征在于三对α-PCR引物分别为a2F和a 2R，a Fl 和a Rl, aF2禾口 aR2，三对β-PCR引物分别为IF-β和IRm禾口 2R_3，3F_3和 3R-3，序列如下
权利要求
1.一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒，由PCR试剂、低密度芯片、杂交试剂组成，其中PCR试剂包括α-PCR管和β-PCR管，α-PCR管由三对α-PCR引物、酶及 PCR反应的其它常规组分组成，β-PCR管由三对β-PCR引物、酶及PCR反应的其它常规组分组成，其特征在于三对α-PCR引物分别为a2F和a 2R，a Fl和a Rl, a F2和aR2，三对β -PCR引物分别为IF- β禾口 IR- β，2F- β禾口 2R- β，3F- β禾口 3R- β，序列为a 2F 5' -GGTGGAGGGTGGAGACGTCCTGGCC-3‘ a 2R 5' -CACCTCCATTGTTGGCACATTCCGGGA-3‘ a Fl 5' -GCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAG-3‘ a Rl 5' -GTGCGCGTGCAGGTCGCTCAGGGCGGACAG-3‘ a F2 5' -CTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACT-3‘ a R2 5' -GCTGCTGCCCACTCAGACTTTATTCAAAG-3‘ IF-β 5' -AGTAGCAATTTGTACTGATGGTATGG-3‘ IR-β 5' -CCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACC-3‘ 2F-0 5' -GATAGGCACTGACTCTCTCTGC-3‘ 2R-3 5' -GAACTTAACCATAGAAAAGAAGG-3‘ 3F-0 5' -GTATCATGCCTCTTTGCACCATTC-3‘ 3R-0 5' -CACACAGACCAGCACGTTGCCCAGGAGC-3'。
2.根据权利要求
1所述的试剂盒，其特征还在于PCR试剂中引物a2F，a2R终浓度为 0·2μΜ，弓丨物 a Fl, a F2, IF-β，2F-3 禾口 3F-3 终浓度为 0· 01 μ Μ，弓丨物 a Rl, a R2, IR-β， 2R- β和3R- β终浓度为0. 2 μ Μ。
3.根据权利要求
1所述的试剂盒，其特征还在于PCR试剂中的酶为热启动酶或Taq酶。
4.根据权利要求
1所述的试剂盒，其中低密度芯片由膜、点在膜上的检测a、 β -Globin基因突变位点的特异性探针组成，其特征在于特异性探针的序列为■cod30N5'-GGCCCTGGAGAGGTGAG-3'■cod30M5'-AGGCCCTGAGGTGAGG-3'■cod31N5'-CCTGGAGAGGTGAGGCT-3'■cod31M5'-CCTGGAGAAGTGAGGCT-3'■cod59N5'-GGGCCACGGCAAGAAGG-3'■cod59M5'-GGGCCACGACAAGAAGG-3'-WM-codl22N5'-GCGGTGCACGCCTCCCT--3'-WM-codl22M5'-GCGGTGCAGGCCTCCCT--3'-QS-codl25N5'-CGCCTCCCTGGACAAGT--3'-QS-codl25M5'-CGCCTCCCCGGACAAGT--3'-CS-codl42N5'-AATACCGTTAAGCTGGAGC--3-CS-codl42M5'-AATACCGTCAAGCTGGAGC--3ΤΑΤΑ32-Ν 5 ‘ -TGGGCATAAAAGTCAGTG-3‘ ΤΑΤΑ32-Μ 5 ‘ -TGGGAATAAAAGTCAGGTG-3‘ ΤΑΤΑ30-Ν 5‘ -GGCATAAAAGTCAGGGCTA-3‘ ΤΑΤΑ30-Μ 5‘ -GGCACAAAAGTCAGGGCTA-3‘TATA29-N 5‘ -GCATAAAAGTCAGGGCATG-3‘ TATA29-M 5‘ -GCATGAAAGTCAGGGCATG-3‘ TATA28-N 5‘ -GCATAAAAGTCAGGGCAGATG-3‘ TATA28-M 5‘ -GCATAGAAGTCAGGGCAGATG-3‘ Cap+1-N 5' -CTATCTATTGCTTACATTTG-3‘ Cap+1-M 5' -CTATCTATTGCTTCCATTTG-3‘ Cap40-43-N 5‘ -GCAACCTCAAACAGACA-3‘ Cap40-43-M 5‘ -GCAACCTCAGACACCAT-3‘ Innitiation-N 5 ‘ -CTAAACAGACACCATGGTG-3‘ Innitiation-M 5 ‘ -CTAAACAGACACCAGGGTG-3‘ CD8-N 5‘ -CTGAGGAGAAGTCTGC-3‘ CD8-M 5‘ -CTGAGGAGGTCTGCCG-3 ‘ CD8/9-N 5‘ -CTGAGGAGAAGTCTGC-3‘ CD8/9-M 5‘ -TGAGGAGAAGGTCTGC-3‘ CD14/15-N 5‘ -TTACTGCCCTGTGGG-3‘ CD14/15-M 5' -TTACTGCCCTGGTGG-3‘ CD17-N 5' -CTCCTGTGGGGCAAGGTGA-3‘ CD17-M 5‘ -CTCCTGTGGGGCTAGGTGA-3‘ CD19-N 5' -GGTGAACGTGGATGAAGTTAG-3‘ CD19-M 5' -GGTGGACGTGGATGAAGTTAG-3‘ CD26-N 5‘ -GTAAGTTGGTGGTGAGGC-3‘ CD26-M 5‘ -GTAAGTTGGTGGTAAGGC-3‘ CD27/28-N 5' -TGGTGAGGCCCTGG-3‘ CD27/28-M 5' -TGGTGAGGCCCCTG-3‘ CD30-N 5‘ -CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC-3‘ CD30-M 5‘ -CTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC-3‘ CD31-N 5' -CTTAGGCTGCTGGTGGTC-3‘ CD31-M 5' -CCTTAGGTGCTGGTGGTC-3‘ CD37-N 5' -CCTTGGACCCAGAGGTTAC-3‘ CD37-M 5' -CCTTAGACCCAGAGGTTAC-3‘ CD41-N 5‘ -TGGACCCAGAGGTTCTTTG-3‘ CD41-M 5' -TGGACCCAGAGGTTTCTTTG-3‘ CD41/42-N 5‘ -GGTTCTTTGAGTCCTTTG-3‘ CD41/42-M 5' -GGTTGAGTCCTTTGGGGA-3‘ CD43-N 5' -CTTTGAGTCCTTTGGGGACT-3‘ CD43-M 5' -CTTTTAGTCCTTTGGGGACT-3 ‘ 71/72-N 5' -GGTGCCTTTAGTGATGG-3‘ 71/72-M 5' -TCGGTGCCTTTTAGTGATG-3‘ CD95-N 5' -ACTGTGACAAGCTGCAC-3‘CD95-M 5 ‘ -ACTGTGACAAAGCTGCAC-3‘ IVSI-I-N 5' -GGCAGGTTGGTATCAAGT-3‘ IVSI-I-M 5' -GGCAGTTTGGTATCAAGT-3‘ IVSII-I-N 5' -GTTGGTATCAAGGTTACTA-3‘ IVSII-I-M 5' -GTTGCTATCAAGGTTACAA-3‘ IVSII-5-N 5' -GTAACTTCAGGGTGAGTCT-3‘ IVSII-5-M 5' -GTAACTTCAGGGTGACTCT-3‘ IVSII-nt654-N 5 ‘ -TAAGGCAATAGCAATATAC-3‘ IVSII-nt654-M 5 ‘ -TAAGGTAATAGCAATATAC-3‘ 显色控制点5' -GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3 ‘。
5.根据权利要求
1所述的试剂盒，其特征还在于低密度芯片中特异性探针的点样量为 5pmolο
6.根据权利要求
1所述的试剂盒，其特征还在于低密度芯片中膜的材料为硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素。
7.根据权利要求
1所述的试剂盒，其中杂交试剂由杂交液I、杂交液II、酶、显色液组成，其特征在于杂交液I的组成为2XSSC，0. 5% SDS，杂交液II的组成为0. 5X SSC, 0. 5% SDS。
8.根据权利要求
1所述的试剂盒，其特征还在于杂交试剂中酶为辣根过氧化物酶，用量为0. IU0
9.根据权利要求
1所述的试剂盒，其特征还在于显色液中显色底物包括TMB或0PD。
专利摘要
本发明涉及一种一体化检测α、β突变型地中海贫血的试剂盒，特别是涉及一种利用多重不对称扩增及反向点杂交技术检测α、β地中海贫血突变型的试剂盒。本发明的试剂盒由PCR试剂、低密度芯片、杂交试剂三部分组成，包含一套特异性核苷酸多态性探针和扩增样品中靶基因的PCR引物，可以同时检测中国常见的6种α地贫点突变和27种β地贫突变。由于本发明的试剂盒检测过程更加快速，检测结果也更为准确，将广泛应用于临床地中海贫血的诊断及优生优育指导。
文档编号C12Q1/68GKCN102220411SQ201010152735
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月16日
发明者何蕴韶, 张太松, 彭春梅, 李明, 林炳生, 程钢, 陈华云 申请人:中山大学达安基因股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan