专利名称：一种β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉 及分子生物学领域，具体涉及一种检测基因突变的荧光定量PCR试剂盒，尤其涉及一种β -地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术：
地中海贫血(thalassem ia)简称“地贫”，是世界上最常见的血液遗传病之一。地中海贫血临床表型多样，由轻到重，可以从正常到反复输血，甚至危及生命，导致患者在未成年即夭折甚至胎死腹中，给家庭和社会带来巨大的精神及经济负担。而且，目前医学上尚无有效的治疗措施；因此，控制和降低地贫患儿的出生率才能有效地监控此类疾病的发生。通过人群筛查和遗传咨询，对那些携有地贫基因的育龄夫妇所孕胎儿实施产前诊断和基因诊断，是现实条件下控制重症地贫患儿出生最有效的途径。地中海贫血是自体隐性遗传疾病，因珠蛋白链的合成障碍所产生，表现为红细胞体积较小和寿命缩短。通常根据珠蛋白链的种类将地中海贫血分为α、β、Y、δ β等类型，其中以α、β地中海贫血最为常见,而β地中海贫血危害最大。其中，地中海贫血是一种以珠蛋白肤链合成缺陷为特征的遗传性溶血性贫血，主要为β珠蛋白基因点突变、小的缺失或插入。目前全世界已发现的地中海贫血突变约170种，在中国人中已发现21种。大量的研究结果表明β_地中海贫血基因突变及频率分布具有明显的种族特征及地域差异。医学统计发现中国人常见的突变依次为⑶41-42缺失突变(41.6%)、IVS-2nt654(C —T)突变(21.8%)、CD17 (A — T)无义突变(18. 0%)、ΤΑΤΑ 盒 nt_28 (A —G)突变(8%)、CD71-72 (+A)移码突变(3. 9%),TATA盒nt_29突变(I. 2%);这六种突变的基因频率占中国人地贫基因的94%以上，其中⑶41-42缺失突变是中国人最常见的突变类型。因此，对相关基因型进行准确的诊断，对于地中海贫血诊断和和防治具有重大的意义。现有技术中已有的β地中海贫血常用分子诊断方法包括PCR结合特异寡核苷酸探针(PCR-ASO)斑点杂交法、反向杂交(RDB)法、突变寡聚核苷酸延伸扩增PCR(mutant oligonu2cleo tide extension amplification, MOEA)技术、多重等位基因特异 PCR(multiplex allele specific PCR, MAS-PCR)法、等位基因特异性扩增技术(allelespecific, A SPCR)、基因芯片法等。其中，PCR结合特异寡核苷酸探针(PCR-ASO)斑点杂交法一次检测只针对一种突变，一般完成未知样品的诊断通常需多次重复检测，所以颇为费时费力。反向杂交(RDB)法存在PCR扩增不良，杂交膜条上探针太弱或膜条洗涤不充分等原因，会导致假阳性或假阴性结果的出现。突变寡聚核苷酸延伸扩增PCR技术较适于检测已知DNA点突变的β地中海贫血，需进行电泳，较费时费力。基因芯片法简便、快速、微量化、自动化、一次能平行筛查更多甚至全部已知突变类型的新方法，但需购进昂贵的仪器设备进行检测，难以推广普及。实时突光定量PCR 技术(real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它是一种在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的突光探针,该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时，探针结合在DNA任一一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。因此，结合荧光定量PCR技术的诸多优点，开发出一种能够快速、准确、高敏感度的检测β -地中海贫血基因特定位点突变的荧光定量PCR检测试剂盒是业界亟待解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明所解决的技术问题在于提供一种β_地中海贫 血突变荧光定量PCR检测试剂盒，能够快速、准确、高敏感度地检测β -地中海贫血基因的突变情况，尤其是针对中国人常见的6种β-地中海贫血基因特定位点突变。本发明的β -地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测β -地中海贫血突变基因型的荧光探针，所述PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处基因区段的PCR引物。优选地，所述突变位点包括β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变、β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的C — T碱基突变、β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的A — T碱基突变、β -珠蛋白基因启动子上游第28位对应的A — G碱基突变、β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的+A碱基插入突变、β -珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的G — C碱基突变中的至少一种。其中，所述PCR引物包括以下两组引物对中的至少一组针对β-珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 2所示:Al :5，-CATAACAGCATCAGGAGTGGACAG-3，(SEQ ID NO:I);Α2 :5’ -ACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT-3’ (SEQ ID NO:2);针对β-珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:5所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:6所示:BI :5’ -TGGTAGCTGGATTGTAGCTGCTATTA-3’ (SEQ ID NO:5);B2:5’ -TTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGA-3’ (SEQ ID NO:6)；针对β-珠蛋白基因启动子上游第28位对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:9所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 10所示:Cl :5’ -CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATA-3’ (SEQ ID NO:9)；C2:5， -TGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTG-3， (SEQ ID NO:10)；针对β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 13所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 14所示:Dl :5’ -GTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGAT-3’ (SEQ ID NO:13)；
D2:5， -TGTCATCACTTAGACCTCACCCTGT-3’ (SEQ ID NO:14)；针对β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 17所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 18所示:El :5，-GCCCTTGAGGTTGTCCAGGT-3，(SEQ ID NO:17)；E2:5， -TATGGGCAACCCTAAGGTGAAG-3， (SEQ ID NO:18)；针对β-珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:21所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:22所示:Fl :5’ -TGTCTCCACATGCCCAGTTTC-3’ (SEQ ID NO:21)；
F2:5， -CCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTA-3’ (SEQ ID NO:22)。优选地，所述荧光探针包括如SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20, SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24所示的核苷酸序列中的至少一种A3 :5，-HEX-AGGACTCAAAGAACCT-MGB-3’ (SEQ ID NO:3，野生型)；A4 :5’ -FAM-AAGGACTCAACCTCT-MGB-3’(SEQ ID NO:4，突变型)；B3 :5，-HEX-TGCTATTGCCTTAACC-MGB-3，(SEQ ID NO:7，野生型)；B4 :5，-FAM-TTGCTATTACCTTAACCC-MGB-3’(SEQ ID NO:8，突变型)；C3 :5，-HEX-CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-TAMRA-3，(SEQ ID NO: 11，野生型)；C4 :5，-FAM-CCACGTTCACCTAGCCCCACAGG - TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 12，突变型)；D3 :5，-HEX-TGCCCTGACTTTTATGCCCAGCC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 15，野生型)；D4 :5，-FAM-TGCCCTGACTTCTATGCCCAGCC - TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 16，突变型)；E3 :5，-HEX-CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAG-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 19，野生型)；E4 :5，-FAM-CAGGCCATCACTTAAAGGCACCGA - TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 20，突变型)；F3 :5，-HEX-CCTTGATACCAACCTG-MGB-3’ (SEQ ID NO:23，野生型)；F4 :5，-FAM-CCTTGATAGCAACCTG-MGB-3’(SEQ ID NO: 24，突变型)。优选地，所述荧光探针包括以下探针组合中的至少一组检测β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ；检测β-珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合SEQ ID Ν0:7和SEQ ID Ν0:8 ；检测β -珠蛋白基因启动子上游第28位对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ；检测珠蛋白基因第17位氨基酸对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 ；检测β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:20 ；检测珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24。优选地，所述阳性对照品为存在β -珠蛋白基因突变的质粒DNA，β -珠蛋白的基因突变位点包括珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变、β-珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的C — T碱基突变、β-珠蛋白基因第17位氨基酸对应的A-T碱基突变、β -珠蛋白基因启动子上游第28位对应的A — G碱基突变、β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的+A碱基插入突变、β -珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的G — C碱基突变中的至少一种。其中，检测野生型β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应碱基的野生型探针A3 5’-HEX-AGGACTCAAAGAACCT-MGB-3’ (SEQ ID N0:3)，检测 β -珠蛋白基因第 41/42 位氨基酸对应的碱基缺失的探针 Α4 :5’-FAM-AAGGACTCAACCTCT-MGB-3’ (SEQ ID NO:4)，因此，当所述荧光探针包括如SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4—种或者两种时，所述阳性对照品是存在β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变的质粒DNA。同理，检测野生型珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应碱基的野生型探针 Β3 :5’-HEX-TGCTATTGCCTTAACC-MGB-3’(SEQ ID N0:7)，检测 β-珠蛋白基因第二个内含子的第 654 位碱基突变的探针 Β4 :5’-FAM-TTGCTATTACCTTAACCC-MGB-3’ (SEQ ID N0:8),当所述荧光探针包括如SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8 —种或者两种时，所述阳性对照品是 存在β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的C — T碱基突变的质粒DNA。检测野生型β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应碱基的野生型探针C3 :5’-HEX_CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 11)，检测 β-珠蛋白基因第 17 位氨基酸对应的碱基突变的探针 C4 :5’-FAM-CCACGTTCACCTAGCCCCACAGG-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 12)，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 —种或者两种时，所述阳性对照品是存在β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的A — T碱基突变的质粒DNA。检测野生型β -珠蛋白基因启动子上游第28位碱基的野生型探针D3 :5’-HEX_TGCCCTGACTTTTATGCCCAGCC-TAMRA-3’(SEQ ID NO: 15)，检测 β -珠蛋白基因启动子上游第 28位碱基突变的探针 D4 :5’-FAM-TGCCCTGACTTCTATGCCCAGCC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 16)，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16—种或者两种时，β-珠蛋白基因启动子上游第28位对应的A — G碱基突变的质粒DNA。检测野生型β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应碱基的野生型探针Ε3 :5’_ΗΕΧ-CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAG-TAMRA-3’(SEQ ID NO: 19)，检测 β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的碱基突变的探针 Ε4 :5’ -FAM-CAGGCCATCACTTAAAGGCACCGA - TAMRA-3’ (SEQ IDNO: 20)，当所述荧光探针包括如SEQ ID Ν0:19和SEQ ID NO: 20—种或者两种时，β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的+A碱基插入突变的质粒DNA。检测野生型珠蛋白基因第一个内含子的第5位碱基的野生型探针F3:5’-HEX-CCTTGATACCAACCTG-MGB-3’ (SEQ ID N0:23)，检测 β -珠蛋白基因第一个内含子的第 5 位碱基突变的探针 F4 :5’ -FAM-CCTTGATAGCAACCTG - MGB-3’ (SEQ ID NO: 24)，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 24—种或者两种时，β-珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的G — C碱基突变的质粒DNA。优选地，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，荧光探针的3’端标记有荧光猝灭基团。需要说明的是，上述探针序列SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:7,SEQ IDNO:8,SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20,SEQ ID Ν0:23和SEQ ID NO:24是序列表中对应核苷酸序列在标记荧光报告基团和荧光淬灭基团后的具体实现方式。在本发明的优选实施方式中，如上述探针序列所示，(O荧光探针SEQ ID N0:A3的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID N0:A4的Y端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。(2)荧光探针SEQ ID N0:B3的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID N0:B4的5'端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。(3)荧光探针SEQ ID N0:C3的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID NO: C4的5'端标记FAM荧光报告基团，3 ’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
(4)荧光探针SEQ ID N0:D3的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID N0:D4的Y端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。(5)荧光探针SEQ ID N0:E3的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端均记TAMRA荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID N0:E4的Y端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。(6)荧光探针SEQ ID N0:F3的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID N0:F4的5'端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。当然在本发明的其他实施中，标记不同的荧光报告基团是为了荧光定量PCR能够采集到不同波长的荧光已便区分，因此采用其他本领域技术已公开的荧光报告基团和荧光 淬灭基团，在不影响检测效果的情况下，也应当理解为属于本发明的保护范围。从原理上讲，地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒是采用荧光定量PCR方法对地中海贫血基因突变进行检测。针对地中海贫血基因突变位点分别特异设计野生型TaqMan探针和突变型TaqMan探针各一对，当遇到野生型核苷酸序列时，野生型TaqMan探针能与之完全结合，在PCR扩增过程中发出相应荧光信号而被检测到；而当遇到突变型核苷酸序列时，突变型TaqMan探针可与之完全结合，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测地中海贫血基因相应位点突变状态的目的。本发明提供的两端都标有突光发光基团的特异性突光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做突变样本具体含量的定量检测。相比于现有检测方法，本发明采用荧光定量PCR技术检测β -地中海贫血基因的突变具有以下优势I、检测灵敏度高，特异性好本发明针对野生型和突变型位点分别设计了两条特异性荧光探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低。2、线性关系好，可定量检测，由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量，误差小，目前的其他检测方法只能进行定性检测，而FQ-PCR可以实现真正的定量检测。3、本技术对标本DNA获取的质量要求较低，无论是石蜡组织还是新鲜组织，都能取得理想的检测结果，PCR-ASO、RDB法等对标本的要求均较高，往往须经历多个繁琐的处理步骤。4、检测时间短，从标本送检到得出结果可在12个小时以内完成；而且，没有后处理，不用杂交、电泳、拍照。5、操作简单，自动化程度高，FQ-PCR技术对PCR产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少，因此也就降低了结果偏差的几率。6、结果判读明确、直观；若需要亦可对结果进行定量分析。直接测序法结果的判读需将测序峰形图人工读出序列，再将所读出的序列结合基因库中的原始序列一起分析，从而得到结果，荧光定量PCR法结果的判读在域值线以上有扩增曲线的标本均为阳性标本，结果判读非常简单，直观。7、检测的样本量大，通过高通量PCR仪，一次最多可检测384例。
8、安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
图I是荧光定量PCR检测β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变(⑶41-42缺失突变)的扩增曲线图；图2是通过直接测序法检测β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变(CD41-42缺失突变)的结果图；图3是荧光定量PCR检测珠蛋白基因第二个内含子的第654位碱基突变(IVS-11-654 (C — Τ)的扩增曲线图；图4是通过直接测序法检测β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位碱基突变(IVS-11-654 (C - Τ)的结果图；图5是荧光定量PCR检测珠蛋白基因第17位氨基酸对应的碱基突变(CD17(A — T))的扩增曲线图；图6是通过直接测序法检测β_珠蛋白基因第17位氨基酸对应的碱基突变(CD17(A — T))的结果图；图7是荧光定量PCR检测珠蛋白基因启动子上游第28位碱基突变(TATA boxnt-28 (A — G))的扩增曲线图；图8是通过直接测序法检测β -珠蛋白基因启动子上游第28位碱基突变(ΤΑΤΑbox nt-28 (A — G))的结果图；图9是荧光定量PCR检测珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的碱基突变(CD71-72(+A))的扩增曲线图；图10是通过直接测序法检测β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的碱基突变(CD71-72(+A))的结果图；图11是荧光定量PCR检测珠蛋白基因第一个内含子的第5位碱基突变(IVS-I-5 (G — C))的扩增曲线图；图12是通过直接测序法检测β_珠蛋白基因第一个内含子的第5位碱基突变(IVS-I_5(G —C))的结果图；图13是荧光定量PCR检测β_珠蛋白基因突变阴性样品的扩增曲线图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。样本说明下来实施例中所用阳性样本收集自中山大学附属肿瘤医院病理科临床病理诊断为β_地中海贫血特定位点突变的蜡块组织。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。实施例I : β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变(⑶41_42缺失突变)的检测样本说明阳性样本收集自中山大学附属肿瘤医院病理科临床病理诊断为β_地中海贫血特定位点突变的蜡块组织。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应 用。设计能特异性检测β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失的探针及公用引物各一对其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO:2所示Al :5，-CATAACAGCATCAGGAGTGGACAG-3，(SEQ ID NO:I);A2 :5， -ACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATT-3’ (SEQ ID NO:2);突光探针为A3 :5，-HEX-AGGACTCAAAGAACCT-MGB-3’(SEQ ID NO:3);A4 :5’ -FAM-AAGGACTCAACCTCT-MGB-3’(SEQ ID NO:4);其中，检测野生型β_珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应碱基的探针A3 5’-HEX-AGGACTCAAAGAACCT-MGB-3’ (SEQ ID NO: 3)，检测 β -珠蛋白基因第 41/42 位氨基酸对应的碱基缺失的探针 Α4 :5’-FAM-AAGGACTCAACCTCT-MGB-3’ (SEQ ID Ν0:4)，荧光探针SEQ ID Ν0:3的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID Ν0:4的5'端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探针各 O. 2μ I (20 μ Μ)，样品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反应条件95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，64°C 33秒，扩增反应45个循环。。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4—种或者两种时，所述阳性对照品是存在β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变的质粒DNA。如图I所示，左边灰色曲线为CD41-42突变型样本对应检测孔荧光定量PCR扩增曲线，右边黑色曲线为CD41-42突变型样本非对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线，即正常和突变基因均有检出，因此样本为杂合突变型。另外，将上述实施例I中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出β_珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变的样本。如图2所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因突变，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的β_地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变情况。实施例2 : β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位碱基突变(IVS-II-654(C —T))的检测设计能特异性检测β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位碱基突变的探针及公用引物各一对其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO:5所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO:6所示BI :5’ -TGGTAGCTGGATTGTAGCTGCTATTA-3’ (SEQ ID NO:5);B2:5’ -TTGCACCATTCTAAAGAATAACAGTGA-3’ (SEQ ID NO:6)；
突光探针为B3 :5’ -HEX-TGCTATTGCCTTAACC-MGB-3’ (SEQ ID NO:7);B4 :5’ -FAM-TTGCTATTACCTTAACCC-MGB-3’(SEQ ID NO:8);其中，检测野生型β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应碱基的探针Β3 5’-HEX-TGCTATTGCCTTAACC-MGB-3’ (SEQ ID N0:7)，检测 β -珠蛋白基因第二个内含子的第 654 位碱基突变的探针 Β4 :5’-FAM-TTGCTATTACCTTAACCC-MGB-3’ (SEQ ID N0:8)，荧光探针SEQ ID N0:7的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID N0:8的5'端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探针各 O. 2μ I (20 μ Μ)，样品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反应条件95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，64°C 33秒，扩增反应45个循环。。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8—种或者两种时，所述阳性对照品是存在β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的C — T碱基突变的质粒DNA。如图3所示，右边灰色曲线为IVS-II_654(C — T)突变样本对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线，左边黑色曲线为IVS-II-654(C —T)突变样本非对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线。另外，将上述实施例2中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出β_珠蛋白基因第二个内含子的第654位碱基突变的样本。如图4所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因突变，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的β_地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位碱基突变情况。实施例3 β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的碱基突变(⑶17 (Α — Τ))的检测设计能特异性检测β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的碱基突变的探针及公用引物各一对PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:9所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 10所示Cl :5’ -CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATA-3’ (SEQ ID NO:9)；
C2:5’ -TGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTG-3’ (SEQ ID NO:10)；突光探针为C3 :5’ -HEX-CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:11)；C4 :5’ -FAM-CCACGTTCACCTAGCCCCACAGG-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:12)；其中，检测野生型珠蛋白基因第17位氨基酸对应碱基的探针C3 :5’-HEX_CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-TAMRA-3’(SEQ ID NO: 11)，检测 β -珠蛋白基因第 17 位氨基酸对应的碱基突变的探针 C4 :5’-FAM-CCACGTTCACCTAGCCCCACAGG-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 12)，荧光探针SEQ ID NO: 11的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID NO: 12的Y端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探针各 O. 2μ I (20 μ Μ)，样品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqman universal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反应条件95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，64°C 33秒，扩增反应45个循环。。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 —种或者两种时，所述阳性对照品是存在β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的A — T碱基突变的质粒DNA。如图5所示，左边灰色曲线为⑶17 (A —Τ)突变样本对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线，右边黑色曲线为CD17 (Α — Τ)突变样本非对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线。另外，将上述实施例3中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出β_珠蛋白基因第17位氨基酸对应的碱基突变的样本。如图6所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因突变，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的碱基突变情况。实施例4 :β-珠蛋白基因启动子上游第28位碱基突变(TATA box nt_28(A —G))的检测设计能特异性检测β -珠蛋白基因启动子上游第28位碱基突变的探针及公用引物各一对其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 13所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO: 14所示Dl :5，-GTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGAT-3，(SEQ ID NO:13)；D2:5， -TGTCATCACTTAGACCTCACCCTGT-3’ (SEQ ID NO:14)；突光探针为D3 :5，-HEX-TGCCCTGACTTTTATGCCCAGCC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:15)；D4 :5’ -FAM-TGCCCTGACTTCTATGCCCAGCC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:16)；检测野生型β -珠蛋白基因启动子上游第28位碱基的探针D3 :5’-HEX-TGCCCTGACTTTTATGCCCAGCC-TAMRA-3’(SEQ ID NO: 15)，检测β -珠蛋白基因启动子上游第28位碱基突变的探针 D4 :5’-FAM-TGCCCTGACTTCTATGCCCAGCC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO: 16)，荧光探针SEQ ID NO: 15的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID NO: 16的Y端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。
然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探针各 O. 2μ I (20 μ Μ)，样品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反应条件95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，64°C 33秒，扩增反应45个循环。。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16—种或者两种时，β-珠蛋白基因启动子上游第28位对应的A — G碱基突变的质粒DNA。如图7所示，左边灰色曲线为TATA box nt-28 (A — G)突变样本对应检测孔荧光定量PCR扩增曲线，右边黑色曲线为TATA box nt-28 (A - G)突变样本非对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线。另外，将上述实施例4中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出β_珠蛋白基因启动子上游第28位碱基突变的样本。如图8所示，通过 测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因突变，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的β_地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定β -珠蛋白基因启动子上游第28位碱基突变情况。实施例5 β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的碱基突变(⑶71_72 (+Α))的检测设计能特异性检测β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的碱基突变的探针及公用引物各一对其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 17所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO: 18所示El :5，-GCCCTTGAGGTTGTCCAGGT-3，(SEQ ID NO:17)；E2:5， -TATGGGCAACCCTAAGGTGAAG-3， (SEQ ID NO:18)；突光探针为E3 :5，-HEX-CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAG-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:19)；E4 :5’ -FAM-CAGGCCATCACTTAAAGGCACCGA - TAMRA-3’ (SEQ ID NO:20)；检测野生型β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应碱基的探针Ε3 :5’-HEX-CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAG-TAMRA-3’(SEQ ID NO: 19)，检测 β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的碱基突变的探针 Ε4 :5’-FAM-CAGGCCATCACTTAAAGGCACCGA-TAMRA-3’ (SEQ ID NO:20)，荧光探针SEQ ID NO: 19的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端均记TAMRA荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID N0:20的Y端标记FAM荧光报告基团，3’端标记TAMRA荧光淬灭基团。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探针各 O. 2μ I (20 μ Μ)，样品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反应条件95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，64°C 33秒，扩增反应45个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，当所述荧光探针包括如SEQ ID N0:19和SEQ ID NO:20—种或者两种时，β-珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的+A碱基插入突变的质粒DNA。如图9所示，右边蓝色曲线为⑶71-72 (+Α)突变样本对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线，左边黑色曲线为CD71-72(+A)突变样本非对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线。另外，将上述实施例5中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出β_珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的碱基突变的样本。如图10所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因突变，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的β_地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的碱基突变情况。实施例6 : β -珠蛋白基因第一个内含子的第5位碱基突变(IVS-I_5(G — C))的检测设计能特异性检测β_珠蛋白基因第一个内含子的第5位碱基突变的探针及公用引物各一对
其中，PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:21所示，PCR反向引物的序列如SEQ IDNO:22所示Fl :5’ -TGTCTCCACATGCCCAGTTTC-3’ (SEQ ID NO:21)；F2:5’ -CCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTA-3’ (SEQ ID NO:22)。突光探针为F3 :5’ -HEX-CCTTGATACCAACCTG-MGB-3’ (SEQ ID NO:23)；F4 :5’ -FAM-CCTTGATAGCAACCTG-MGB-3’(SEQ ID NO:24)。检测野生型β -珠蛋白基因第一个内含子的第5位碱基的探针F3 :5’ -HEX-CCTTGATACCAACCTG-MGB-3’ (SEQ ID N0:23)，检测 β -珠蛋白基因第一个内含子的第 5 位碱基突变的探针 F4 :5’-FAM-CCTTGATAGCAACCTG-MGB-3’ (SEQ ID NO: 24)，荧光探针SEQ ID NO:23的5'端标记HEX荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团；荧光探针SEQ ID NO: 24的5'端标记FAM荧光报告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20μΜ)，探针各 O. 2μ I (20 μ Μ)，样品模板 DNA 2· 5 μ I (100_300ng/μ I)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ L· PCR 反应条件95°C预变性30sec ;并按95°C 5秒，64°C 33秒，扩增反应45个循环。同时在荧光定量试验中，需要检测样品的同时，还需要设置样品参考品，以确定试验的有效性，当所述荧光探针包括如SEQ ID N0:23和SEQ ID NO:24—种或者两种时，β-珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的G — C碱基突变的质粒DNA。如图11所示，左边灰色曲线为IVS-I_5(G — C)突变样本对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线，右边黑色曲线为IVS-I-5(G —C)突变样本非对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线。另外，将上述实施例6中的样品进行测序验证，发现在本实施例中由上述荧光定量检测试验检测出β_珠蛋白基因第一个内含子的第5位碱基突变的样本。如图12所示，通过测序结果可以看出确实在该位点发生相应的基因突变，其与荧光定量检测试验的结果完全一致。以此发现采用本发明的β_地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒能够准确地确定β-珠蛋白基因第一个内含子的第5位碱基突变情况。实施例7 阴性样品的检测分别用实施例1-6中的反应液对阴性样品进行荧光，定量PCR检测，检测结果如图7所示，右边蓝色六条曲线为样本对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线，左边六条黑色曲线为样本非对应检测孔的荧光定量PCR扩增曲线。从检查结果可以看出，样本中未检出CD41-42、IVS-II-654(C — T)、CD17(A — Τ)、TATA box nt-28 (A — G)、CD71_72(+A)、IVS-I-5 (G — C) 6 种突变基因型中的任何一种，可确定为地中海贫血阴性。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1.ー种β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测β -地中海贫血突变基因型的荧光探针，所述PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处基因区段的PCR引物。
2.根据权利要求I所述的β_地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在干，所述突变位点包括β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变、β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的C — T碱基突变、β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的A-T碱基突变、β -珠蛋白基因启动子上游第28位对应的A — G碱基突变、β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的+A碱基插入突变、β -珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的G — C碱基突变中的至少ー种。
3.根据权利要求I所述的β_地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在干，所述PCR引物包括以下两组引物对中的至少ー组 针对珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: I所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:2所示; 针对β_珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:5所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:6所示; 针对β -珠蛋白基因启动子上游第28位对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID Ν0:9所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID Ν0:10所示; 针对珠蛋白基因第17位氨基酸对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 13所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 14所示； 针对β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO: 17所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO: 18所示; 针对β -珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的突变位点所处区域的引物对，其PCR正向引物的序列如SEQ ID NO:21所示，PCR反向引物的序列如SEQ ID NO:22所示。
4.根据权利要求I所述的β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针包括如 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20,SEQ IDΝΟ:23和SEQ ID ΝΟ:24所示的核苷酸序列中的至少ー种。
5.根据权利要求4所述的β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在干，所述荧光探针包括以下探针组合中的至少ー组 检测β_珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 ； 检测β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 ； 检测β -珠蛋白基因启动子上游第28位对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ； 检测β_珠蛋白基因第17位氨基酸对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 ； 检测β-珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:20 ；检测β-珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的突变位点和对应区域的野生型基因的探针组合 SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24。
6.根据权利要求4所述的β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在干，所述阳性对照品为存在珠蛋白基因突变的质粒DNA，β-珠蛋白的基因突变位点包括β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变、珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的C — T碱基突变、β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的A — T碱基突变、β -珠蛋白基因启动子上游第28位对应的A — G碱基突变、β -珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的+A碱基插入突变、β -珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的G — C碱基突变中的至少ー种。
7.根据权利要求5所述的β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在干 当所述荧光探针包括如SEQ ID Ν0:3和SEQ ID NO:4 —种或者两种时，所述阳性对照品是存在β -珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变的质粒DNA ； 当所述荧光探针包括如SEQ ID Ν0:7和SEQ ID NO:8 —种或者两种时，所述阳性对照品是存在β -珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的C — T碱基突变的质粒DNA ；当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 —种或者两种时，所述阳性对照品是存在β -珠蛋白基因第17位氨基酸对应的A — T碱基突变的质粒DNA ； 当所述荧光探针包括如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16—种或者两种时，β-珠蛋白基因启动子上游第28位对应的A — G碱基突变的质粒DNA ； 当所述荧光探针包括如SEQ ID Ν0:19和SEQ ID NO: 20—种或者两种时，β-珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的+A碱基插入突变的质粒DNA ； 当所述荧光探针包括如SEQ ID ΝΟ:23和SEQ ID NO:24—种或者两种时，β-珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的G — C碱基突变的质粒DNA。
8.根据权利要求I所述的β_地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在干，所述荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，荧光探针的3’端标记有荧光猝灭基团。
全文摘要
一种β-地中海贫血突变荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合反应液、阳性对照品和用于检测β-地中海贫血突变基因型的荧光探针，PCR混合反应液中包含扩增突变位点所处基因区段的PCR引物。突变位点为β-珠蛋白基因第41/42位氨基酸对应的碱基缺失突变、β-珠蛋白基因第二个内含子的第654位对应的C→T碱基突变、β-珠蛋白基因第17位氨基酸对应的A→T碱基突变、β-珠蛋白基因启动子上游第28位对应的A→G碱基突变、β-珠蛋白基因第71/72位氨基酸对应的+A碱基插入突变、β-珠蛋白基因第一个内含子的第5位对应的G→C碱基突变中的至少一种。本发明的方案能够快速、准确、高敏感度地检测β-地中海贫血基因的突变情况，尤其是针对中国人常见的6种β-地中海贫血基因特定位点突变。
文档编号C12Q1/68GK102851366SQ20121032040
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者邵琦 申请人:广州达健生物科技有限公司