核酸检测装置、方法、及程序的制作方法

专利名称：核酸检测装置、方法、及程序的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸检测装置、方法、及程序。
背景技术：
以往,在利用实时PCR (Polymerase Chain Reaction :聚合酶链反应)等的核酸放大法、融解温度测定中，在对放大或融解的目标核酸的量进行监视的情况下，将与放大或融解的目标核酸的量对应的荧光量转换成电信号，以规定的放大率放大并取得。通常，该放大率固定，所取得的荧光量根据使用者投入的试剂的量进行控制。
另外，提出了在检测从对象物发出的荧光时基于对象物的信息而设定光电转换放大率等的检测条件的荧光检测装置(例如，参照专利文献I)。
另外，提出了一种如下所述的核酸检测装置，即基于预先对于多个检测部作为共通的值决定的目标Α/D值、及与在目标核酸的放大前从检测部输出的接收信号对应的默认对应受光信号Α/D值，对于各检测部，决定用于将默认对应受光信号Α/D值放大成目标A/D 值的调 整后放大率D/Α值(例如，参照专利文献2)。
另外，提出了一种如下所述的光检测装置，即对来自放大器的放大度不同的多个输出进行Α/D转换，选择其中信号未饱和且放大度最大的信号，并对所选择的信号进行处理(例如，参照专利文献3)。
在先技术文献
专利文献
专利文献I日本特开2009-8603号公报
专利文献2日本特开2005-233938号公报
专利文献3日本特开平10-96666号公报
然而，在专利文献I的技术中，使用不同的检测条件(例如，光电转换放大率)下的检测数据，对容许范围外的检测数据进行校正而求出荧光特性值。另外，专利文献2的技术使多个检测部各自的受光电平的变动减少。如此，在专利文献I及2的技术中，存在不能设定用于高精度地检测放大或融解的目标核酸的量的适当的放大率这样的问题。
另外，在专利文献3的技术中，关于从测定开始到结束的全部数据，得到放大度不同的多个输出，因此在测定成为长时间的情况下、由于所取得的信号的电平难以预测而需要宽幅的放大率的设定的情况下，存在存储器容量增大这样的问题。发明内容
本发明为了解决上述问题点而作出，其目的在于提供一种能够设定用于高精度地检测放大或融解的目标核酸的量的适当的放大率的核酸检测装置、方法、及程序。
为了实现上述目的，第一发明的核酸检测装置包括检测单元，其在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量；放大单元，其将由所述检测单元检测到的电信号以规定的放大率放大；及控制单元，其以如下方式进行控制基于在所述放大反应或融解温度测定的初始阶段中由所述检测单元检测到的电信号、及装置的检测极限值，变更在所述初始阶段之后的放大反应或融解温度测定时所检测到的电信号的放大率。
根据第一发明的核酸检测装置，检测单元在目标核酸的放大反应或融解温度测定中的多个时刻，利用与根据目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量。而且，放大单元将由检测单元检测到的电信号以规定的放大率放大。 并且，控制单元进行控制以，基于在放大反应或融解温度测定的初始阶段中由检测单元检测到的电信号、及装置的检测极限值，变更在初始阶段之后的放大反应或融解温度测定时检测到的电信号的放大率。
如此，基于在放大反应或融解温度测定的初始阶段中检测到的电信号、及装置的检测极限值，决定初始阶段之后的放大反应或融解温度测定时的放大率，因此无需对于全部数据得到放大度不同的多个输出，能够削减存储器容量，并能够设定用于高精度地检测放大或融解的目标核酸的量的适当的放大率。
另外，在第一发明中，所述检测单元检测具有随着所述放大反应或融解温度测定进展而电平下降的特性的电信号。
另外，在第一发明中，在所述放大反应或融解温度测定中使用可杂交至所述目标核酸的目标序列的区域的探针。另外，所述探针可以是在未杂交至所述目标序列的区域时发出荧光且在杂交至所述目标序列的区域时荧光强度减小的探针。
另外，在第一发明中，所述控制单元可以在所述初始阶段由所述检测单元检测到的电信号的电平超过预先确定的范围时，进行对所述放大反应或融解温度测定的异常进行通知的控制、及使所述放大反应或融解温度测定停止的控制或不变更所述放大率的控制中的至少一种控制。
另外，为了实现上述目的，第二发明的核酸检测装置包括检测单元，其在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量；放大单元，其将由所述检测单元检测到的电信号以不同的多个放大率放大；及控制单元，其以如下方式进行控制在所述多个时刻的每一时刻，切换所述放大单元的放大率来取得以所述不同的多个放大率分别放大的多个电信号。
根据第二发明的核酸检测装置，检测单元在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量。另外，放大单元将由检测单元检测到的电信号以不同的多个放大率放大。并且，控制单元进行控制以在多个时刻的每一个时刻，切换放大单元的放大率，来取得以不同的多个放大率分别放大的多个电信号。
如此，通过取得以不同的多个放大率放大的多个电信号，而能够应对宽幅的放大率，而且，通过在每个时刻切换放大率来取得该电信号，例如以仅取得以必要的放大率放大的电信号的方式进行切换等，能够灵活地进行放大率的切换。因此，即使在检测到的光量的电平预测困难的情况下，也能够设定用于高精度地检测放大或融解的目标核酸的量的适当的放大率。
另外，在第二发明中，所述控制单元能够进行控制以对所取得的多个电信号中的电平为装置的检测极限值以下的电信号进行存储。由此，能够有效地削减存储器容量。
另外，在第二发明中，所述控制单元能够进行控制以显示所取得的多个电信号中的电平为装置的检测极限值以下、且以与在当前时刻为最大值的电信号对应的放大率放大的电信号在各时刻下的电平。由此，能够进行最有效地利用在当前时刻下装置能够表现的灰度的显不。
另外，在第二发明中，所述控制单元进行控制以在下一时刻以后不取得以与超过了装置的检测极限值的电信号对应的放大率放大的电信号。由此，能够进一步实现存储器容量的削减。
另外，在第二发明中，所述控制单元可以在所取得的多个电信号全部超过了装置的检测极限值时，进行对所述放大反应或融解温度测定的异常进行通知的控制、及使所述放大反应或融解温度测定停止的控制中的至少一种控制。
另外，作为第一及第二发明的所述目标核酸的放大反应，可以列举出实时PCR。
另外，第三发明的核酸检测方法中，在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量，将检测到的电信号以规定的放大率放大，基于在所述放大反应或融解温度测定的初始阶段中检测到的电信号、及装置的检测极限值，变更在所述初始阶段之后的放大反应或融解温度测定时检测到的电信号的放大率。
另外，第四发明的核酸检测方法中，在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量，将检测到的电信号以不同的多个放大率放大，在所述多个时刻的每一个时刻，切换将检测到的电信号放大的放大单元的放大率，来取得以不同的多个放大率分别放大的多个电信号。
另外，第五发明的核酸检测程序，其用于使计算机作为控制单元发挥作用，所述控制单元以如下方式进行控制检测单元在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量，放大单元以规定的放大率放大由所述检测单元检测到的电信号，对于作为所述放大单元的放大率的、在所述放大反应或融解温度测定的初始阶段之后的放大反应或融解温度测定时检测的电信号的放大率，基于在所述初始阶段中由所述检测单元检测到的电信号、及装置的检测极限值来进行变更。
另外，第六发明的核酸检测程序，其用于使计算机作为控制单元发挥作用，所述控制单元以如下方式进行控制检测单元在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量，放大单元以不同的多个放大率放大由所述检测单元检测到的电信号，切换所述放大单元的放大率，来取得通过所述放大单元以所述不同的多个放大率分别放大的多个电信号。
发明效果
如以上说明所述，根据本发明的核酸检测装置、方法、及程序，能得到如下效果能够设定用于高精度地检测放大或融解的目标核酸的量的适当的放大率。


图I是表示本实施方式的核酸检测装 置的结构的框图。
图2是表不放大电路的一例的图。
图3是表示使放大率一定而检测到的荧光值的一例的图形。
图4是表示基于初始阶段的荧光值对调整阶段的放大率进行了变更时的荧光值的一例的图形。
图5是仅表示了图4的调整阶段的荧光值的图形。
图6是表示第一实施方式的核酸检测装置中的核酸检测处理例程的内容的流程图。
图7是表示第一实施方式中的检测结果的显示的一例的图。
图8是表示第一实施方式中的检测结果的显示的另一例的图。
图9是表示第一实施方式中的检测结果的显示的另一例的图。
图10是表示以4级的放大率放大后的荧光值的一例的图形。
图11是表示第二实施方式的核酸检测装置中的核酸检测处理例程的内容的流程图。
图12是表示第二实施方式中的检测结果的显示的一例的图。
图13是表示第二实施方式中的检测结果的显示的另一例的图。
图14是表不放大电路的另一例的图。
标号说明
10核酸检测装置
12光源
14受光部
16、16a 16η放大电路
18多路选择器(multiplexer)
20A/D转换器
22计算机
24显示操作部
30CPU
32R0M
34RAM
36存储器具体实施方式
以下，参照附图，详细说明本发明的核酸检测装置的实施方式。
<第一实施方式>
如图I所示，第一实施方式的核酸检测装置10包括用于向样品照射激励光的由LED等构成的光源12 ;用于接受因激励光的照射而产生的荧光并输出与受光量对应的电平的电信号的由光电二极管等构成的受光部14;将从受光部14输出的电信号以各个放大率放大的多个放大电路16a 16n ;从放大后的电信号中选择I个电信号的多路选择器18 ;将所选择的作为模拟信号的电信号转换成数字信号的Α/D转换器20 ;计算机22 ;通过操作而输入各种信息且用于显示检测结果等的由触摸面板显示器等构成的显示操作部24。
放大电路16a 16η例如可以作为图2所示的反向放大电路构成。图2所示的放大电路16η的放大率η确定为n=l+R2/Rl。因此，以各放大电路16a、16b、…、16η的放大率 a、b、…、η成为所希望的值的方式设定各放大电路16的电阻值Rl及R2。需要说明的是， 各放大电路16a、16b、…、16η的放大率a、b、…、η分别为不同的值。
计算机22包括管理核酸检测装置10整体的控制的CPU30、对后述的核酸检测处理等的各种程序进行存储的作为存储介质的R0M32、作为工作区域而暂时存储数据的RAM34、 存储有各种信息的作为存储单元的存储器36、输入输出口(I/O 口)38、及将它们连接的总线。另外，还可以设置HDD。
接下来，说明第一实施方式的原理。在此，说明随着放大反应进展而产生的荧光量 (从受光部14输出的电信号)的电平下降的反应系统。需要说明的是，以下，将由放大电路 16a 16n分别放大了的电信号也称为“突光值”。
如上所述，在产生的荧光量下降的反应系统中，在放大反应的整个反应时间(全部循环)中，使放大率一定时的荧光值的一例如图3所示。在该图的例子中，使放大率为I倍 (无放大)。基于如此得到的荧光值的变化，进行求出CT值(Threshold Cycle :循环阈值 )的情况等。由于像求取该CT值的情况等那样多使用荧光值的变化大的放大反应的后半部分的数据，因此优选能够更高精度地检测放大反应的后半部分的荧光值。
因此，在第一实施方式的核酸检测装置10中，基于在放大反应的初始阶段的荧光值，将在初始阶段之后的放大反应时(以下，称为“调整阶段”)检测到的电信号的放大率变更为适当的值。具体而言，基于在初始阶段检测到的荧光值，以最大限度地利用装置能够表现的灰度的极限值(检测极限值)而表现所检测的荧光值的方式，变更调整阶段的放大率。 例如，可以作为“检测极限值/初始阶段的荧光值的最大值”而求出放大率。基于初始阶段的荧光值对调整阶段的放大率进行了变更时的荧光值的例子如图4所示。另外，仅显示图4 所示的荧光值的调整阶段的例子如图5所示。由于最大限度地利用装置能够表现的灰度， 因此如图5所示，能够详细地捕捉荧光值的变化，从而能够高精度地检测荧光值。
需要说明的是，在上述的说明中，说明了使用初始阶段的荧光值的最大值来计算放大率的例子，但也可以使用初始阶段的荧光值的平均值等。另外，在计算放大率时，也可以对装置的检测极限值设置规定的容限，使用比实际的检测极限值低的值。通过对检测极限值设置容限，即使在调整阶段的荧光值比初始阶段的荧光值稍高的情况下，也能够不超过检测极限值地检测荧光值。
接下来，说明第一实施方式的核酸检测装置10的作用。在此，说明利用实时PCR 进行目标核酸的放大的情况。首先，在未图示的测定部安置包含检体及探针等的试剂的PCR 反应液(样品)。就在此使用的探针而言，使用如下所述的探针在未杂交至目标核酸的目标序列的区域时发出荧光，在杂交至目标序列的区域时荧光强度减小。例如，可以使用作为鸟嘌呤猝灭探针已知的QProbe (注册商标)那样的所谓荧光猝灭探针。这种情况下，成为检测到的荧光值随着放大反应进展而电平下降的反应系统。接下来，从显示操作部24进行测定开始的指示，由此，通过CPU30来执行图6所示的核酸检测处理例程。
在步骤100中，将表示实时PCR的循环数的变量i设置为I。
接下来，在步骤102中，使实时PCR的第i循环的处理开始。在实时PCR中，通过未图示的温度控制部来控制测定部的温度，使PCR反应液的温度上升至第I温度(例如， 95°C)，保持第I时间(例如，60秒)。在此期间，2条链DNA变性为I条链DNA。接下来，使 PCR反应液的温度下降至第2温度(例如，60°C )，保持第2时间(例如，15秒)。在此期间，产生I条链DNA与引物的退火。接下来，使PCR反应液的温度上升至第3温度(例如，70°C)， 保持第3时间(例如，60秒)。在此期间，通过DNA聚合酶的作用，来合成DNA。将此作为I 循环。
接下来，在步骤104中，检测与在上述步骤102中开始的PCR中产生的荧光量对应的荧光值。具体而言，利用光源12向设置于测定部的PCR反应液照射激励光。通过激励光的照射，在PCR反应液内，产生与由PCR放大了的目标核酸的量对应的荧光。并且，当由受光部14接受到产生的荧光时，输出与受光部14接受到的荧光量对应的电平的电信号。输出的电信号向放大率不同的多个放大电路16a 16n分别输入,按照各放大电路16a 16n的放大率来放大、输出。
另外,从CPU30向多路选择器18输入用于选择以规定的放大率放大的电信号的选择信号。在此，由于在放大反应的初始阶段(I、循环。例如，相对于全部50循环为广15循环)，因此输入用于选择从放大率I倍的放大电路输出的电信号的选择信号。需要说明的是， 初始阶段的放大率并未限定为I倍，只要考虑使用的检体、试剂、及装置的检测极限值而使初始阶段的荧光值为不超过检测极限值的值即可。所选择的电信号由Α/D转换器20转换成数字信号，向计算机22输入，该电信号的电平(荧光值)与循环数i 一起存储在存储器36 中。
接下来，在步骤106中，判定在上述步骤104中检测到的荧光值是否存在异常。基于检体、试剂等的种类，预先确定在初始阶段的荧光值的适应性范围，若检测到的荧光值在该适应性范围内则判定为无异常，向步骤108移动。另一方面，若检测到的荧光值为适应性范围以外，则判定为存在异常，向步骤114移动。
在步骤108中，通过判定表示循环数的变量i是否成为n，而判定初始阶段的荧光值的检测是否结束。在i古η时，由于初始阶段的荧光值的检测还未结束，因此向步骤110 移动，将变量i增加I，返回步骤102，重复进行PCR的下一循环的处理。在i=n时，向步骤 112移动。
在步骤112中，从存储于存储器36的初始阶段(Γη循环)的荧光值取得最大值。 并且，例如，将调整阶段的放大率决定作为“(装置的检测极限值-容限)/初始阶段的荧光值的最大值”。作为一例，在设取得的初始阶段的荧光值的最大值为“220”、设装置的检测极限值为“2000”、设容限为“150”时，调整阶段的放大率可以决定为(2000-150)/220=8. 4 倍。并且，将用于选择以决定了的放大率放大后的电信号的选择信号向多路选择器18输入。需要说明的是，在与决定了的放大率一致的放大率的放大电路不存在时，可以选择来自最接近所决定的放大率且为所决定的放大率以下的放大率的放大电路的电信号。
另一方面，在上述步骤106中判定为荧光值存在异常而向步骤114移动时，以不变更调整阶段的放大率的方式决定。在此，由于初始阶段的放大率为I倍，因此即使在调整阶段，使放大率也为I倍。
接下来，在步骤116中，使变量i增加I，在下一步骤118中，使实时PCR的第i循环的处理开始。
接下来，在步骤120中，与上述步骤104同样地检测荧光值。但是，在经由上述步骤112而向本步骤移动时，用于选择使用初始阶段的荧光值决定的放大率的选择信号向多路选择器18输入。因此，选择以在上述步骤112中决定的放大率放大的电信号。另外，在经由上述步骤114而向本步骤移动时，不变更放大率，因此直接选择从放大率I倍的放大电路输出的电信号。所选择的电信号由Α/D转换器20转换成数字信号，向计算机22输入，与循环数i 一起存储在存储器36中。
接下来，在步骤122中，判定表示循环数的变量i是否成为k，由此来判定整个循环数是否结束。例如，可以使k为50次。在i#k时，整个循环数还未结束，因此返回步骤 116，使变量i增加I，重复进行PCR的下一循环的处理。在i=k时，向步骤124移动。
在步骤124中，将存储在存储器36中的荧光值标绘成例如图7所示的循环数-荧光值的图形，作为检测结果而显示在显示操作部24上，结束处理。
如以上说明那样，根据第一实施方式的核酸检测装置，基于在放大反应的初始阶段检测到的荧光值、及装置的检测极限值，来决定初始阶段之后的放大反应时(调整阶段) 的放大率，因此能够最大限度地利用装置能够表现的灰度来详细地捕捉荧光值的变化，从而能够高精度地检测荧光值。能够自动地设定这种放大率。
另外，通过使用热稳定性高的探针，可以在PCR反应中预先放入探针，另外，可以重复进行温度变化可逆的反应。此外，通过像第一实施方式那样使用猝灭探针，能够根据在 PCR循环的初始阶段检测到的荧光值来类推探针量，测定在该PCR过程中未知的浓度的反应液，能够将后述的Tm解析的光量调整成最适的增益。
需要说明的是，在第一实施方式中，说明了在显示检测结果时，显示将检测到的荧光值直接标绘的图形的情况，但并未限定于此。例如图8所示，也可以将初始阶段的荧光值校正为以在上述步骤112中决定的调整阶段的放大率放大后的值而进行显示。另外，在第一实施方式中，显示每个循环检测到的离散的荧光值，但也可以如图9所示，通过进行平滑化、基线校正，而校正成平滑的图形来进行显示。另外，在第一实施方式中，说明了在全部循环结束后显示检测结果的情况，但也可以在每当I循环结束时标绘荧光值而进行显示。
另外，在第一实施方式中，说明了例如将整个循环数50循环中的f 15循环作为初始阶段的情况，但初始阶段可以适当设定为整个循环数的1/2、1/3、或1/4等。当增多初始阶段的循环数时，能够更适当地决定调整阶段的放大率。当减少初始阶段的循环数时，通过适当设定的放大率能够高精度地检测荧光值的循环数增多。优选根据使用的检体的特征设定适当的初始阶段的循环数。另外，也可以不是循环数而是整个反应时间的1/2、1/3、1/4坐寸ο
另外，在第一实施方式中，说明了当在初始阶段检测到的荧光值存在异常时，以不变更调整阶段的放大率的方式进行控制的情况，但也可以不使放大反应自身停止地进行控制。另外，也可以取代所述控制或与所述控制一起，将表示初始阶段的荧光值产生了异常的情况的消息显示在显示操作部上等而进行通知。
另外，在第一实施方式中，说明了使调整阶段的放大率一定的情况，但也可以将调整阶段的放大率在多级切换。例如，在伴随着放大反应进展而荧光值下降的反应系统中，随着在调整阶段的循环数进展，而以逐渐提升放大率的方式进行切换。
另外，在第一实施方式中，说明了使用如下所述的探针的情况在未杂交至目标核酸的目标序列的区域时发出荧光，而在杂交至目标序列的区域时荧光强度减小，但并未限定于此。也可以使用如下所述的探针在杂交至目标核酸的目标序列的区域时发出荧光而在未杂交至目标序列的区域时荧光强度减小。
另外，在第一实施方式中，说明了随着放大反应进展而荧光值下降的反应系统，但也能够适用于随着放大进展而荧光值增加的反应系统。这种情况下，只要基于检体的种类等，根据初始阶段的荧光值来推定调整阶段的荧光值，并决定能够最大限度地利用装置的检测极限值而表现调整阶段的荧光值那样的放大率即可。
另外，在第一实施方式中，说明了从放大率各不相同的多个放大电路的输出即电信号由多路选择器选择以适当的放大率放大后的电信号来向计算机输入的情况，但并未限定于此。例如，也可以将由放大电路放大的电信号分别向计算机输入，利用CPU选择以适当的放大率放大后的电信号而存储在存储器中。
需要说明的是，在第一实施方式中，说明基于实时PCR进行的放大反应的情况，但在目标核酸的融解温度测定中也可以适用本发明。这种情况下，将上述核酸检测处理例程的I循环形成为每个作为测定点的温度(例如，每l°c)即可。例如，在(Γ ΟΟ 的范围内，每 rc来实施融解温度测定时，将(TlO°C作为初始阶段，将ifioo°c作为调整阶段，基于在初始阶段检测到的荧光值来决定调整阶段的放大率即可。
<第二实施方式>
接下来，说明第二实施方式。需要说明的是，第二实施方式的核酸检测装置的结构与第一实施方式的核酸检测装置10的结构相同，因此标注同一标号而省略详细说明。
接下来，说明第二实施方式的原理。在此，说明随着放大反应进展而产生的荧光量 (从受光部14输出的电信号)的电平增加的反应系统。在产生的荧光量增加的反应系统中， 以4级的放大率放大后的荧光值的一例如图10所示。在该图的例子中，放大率为I倍、I. 8 倍、2. 8倍、及5倍这4级。放大率越大，则越能够有效地利用装置能够表现的灰度的极限值 (检测极限值，在此为例如“256”)，因此能够高精度地检测荧光值。
然而，在图10的例子中，以4级中的最大的放大率(5倍)放大后的荧光值在第21 循环附近超过检测极限值，在这以后的循环中不能取得正确的荧光值。尤其是在荧光值的变化的预测困难时，难以预先设定适当的放大率，假设在上述的例子中仅设定放大率5倍时，变得不能得到正常的检测结果。
因此，如图10所示，通过分别取得以多个放大率放大后的荧光值，来应对宽幅的放大率。但是，若全部循环量取得以各放大率放大后的荧光值，则需要大的存储器容量，因此在放大反应的每I循环，切换多个放大率并取得荧光值。在图10的例子中，在第I循环中，分别取得以I倍放大的(无放大的)荧光值、以I. 8倍放大的荧光值、以2. 8倍放大的荧光值、及以5倍放大的荧光值。接下来，在第2循环中，同样地分别取得以I倍、I. 8倍、2. 8 倍、及5倍放大的荧光值。在第3循环以后也同样地反复进行。如此，在每I循环，切换取得以多个放大率放大的荧光值，从而能够使荧光值饱和的放大率、在能够把握某种程度荧光值的变化等的等级可判断为没有必要的放大率下的荧光值在下一循环以后不再取得。由此，即使在荧光值的电平预测困难的情况下，也能够以多个放大率来应对，且能够削减存储器容量。
另外，在以最大的放大率放大后的荧光值超过了检测极限值时，将以其下面大的放大率放大后的荧光值作为检测结果，由此，成为有效地利用装置能够表现的灰度的检测结果，因此能够高精度地检测荧光值。
接下来，说明第二实施方式的核酸检测装置10的作用。在此，说明以实时PCR进行目标核酸的放大的情况。首先，在未图示的测定部设置包含检体及探针等的试剂的PCR 反应液(样品)。在此使用的探针是利用如下所述的探针在杂交至目标核酸的目标序列的区域时发出荧光且在未杂交至目标序列的区域时荧光强度减小。这种情况下，检测到的荧光值成为随着放大反应进展而电平增加的反应系统。接下来，通过从显示操作部24进行测定开始的指示，而由CPU30来执行图11所示的核酸检测处理例程。需要说明的是，对于与第一实施方式中的核酸检测处理例程相同的处理，标注同一标号而省略详细说明。
在步骤100中，将表示实时PCR的循环数的变量i设置为1，接着，在步骤102中， 使实时PCR的第i循环的处理开始。
接下来，在步骤200中，检测与在上述步骤102中开始的PCR中产生的荧光量对应的荧光值。具体而言，与第一实施方式同样地，由光源12向设置于测定部的PCR反应液照射激励光。通过激励光的照射，在PCR反应液内，产生与由PCR放大了的目标核酸的量对应的荧光。并且，当受光部14接受到产生的荧光时，输出与受光部14接受到的荧光量对应的电平的电信号。所输出的电信号分别向放大率不同的多个放大电路16a 16n输入,按照各放大电路16a 16η的放大率而放大、输出。在此,按照放大电路16a的放大率a、放大电路 16b的放大率b、…、放大电路16η的放大率η的顺序而放大率依次升高。
另外，从CPU30向多路选择器18输入用于切换放大率并进行选择的选择信号。所选择的放大率由CPU30设定，存储在R0M32中。在此，作为初始设定，设定放大率a、b、…、 η的全部。所选择的电信号由Α/D转换器20转换成数字信号，向计算机22输入,该电信号的电平(荧光值)与循环数i及所选择的放大率一起存储在存储器36中。
更具体而言，首先，从CPU30向多路选择器18输入用于选择放大率a的选择信号时，选择从放大率a的放大电路16a输出的电信号。所选择的电信号由Α/D转换器20转换成数字信号，向计算机22输入，该电信号的电平(荧光值)与循环数i及放大率a —起存储在存储器36中。接下来,从CPU30向多路选择器18输入用于选择放大率b的选择信号,与上述同样地，选择从放大率b的放大电路16b输出的电信号,将突光值与循环数i及放大率 b—起存储在存储器36中。按照设定了该处理的放大率反复进行。由此，在循环i中，分别取得以放大率a、b、…、η放大了的突光值。
需要说明的是，以下，将在第i循环中以放大率a放大了的荧光值标记为“荧光值 ia”。以放大率bl放大了的荧光值也同样。
接下来，在步骤202中，判定在上述步骤200中检测到的荧光值中是否存在超过了装置的检测极限值的荧光值。当存在超过检测极限值的荧光值时，向步骤204移动，当不存在时，向步骤210移动。在此，作为哪一个荧光值均未超过检测极限值的情况，向步骤210 移动。
在步骤210中，从存储于存储器36的荧光值中选择在第i循环中检测到的荧光值 (在最接近的上述步骤200中检测到的荧光值)为最大的荧光值。并且，将以与所选择的荧光值对应的放大率放大后的第广第i循环的荧光值显示在显示操作部24上。在此，显示12荧光值二荧光值ia。
接下来，在步骤122中，通过判定表示循环数的变量i是否成为k，来判定整个循环数是否结束。例如，可以使k为50次。在i#k时，由于整个循环数还未结束，因此向步骤 110移动，使变量i增加1，返回步骤102，重复进行PCR的下一循环的处理。
在通过重复进行上述处理而到第20循环为止的哪一个荧光值均未超过检测极限值时，上述步骤210中显示的检测结果的一例如图12所示。在此，由于到第20循环为止的哪一个荧光值均未超过检测极限值，因此以最大的放大率a放大后的荧光值la~荧光值_作为检测结果显示。并且，在接着的第21循环中，当以放大率a放大了的荧光值21a超过了检测极限值时，在上述步骤202中进行肯定判定，向步骤204移动。
在步骤204中，判定在上述步骤200检测到的荧光值中是否存在检测极限值以下的荧光值。当存在检测极限值以下的荧光值时，向步骤206移动，当不存在时，向步骤212 移动。在此，作为仅仅是以放大率a放大了的荧光值21a超过检测极限值而以其他的放大率放大了的荧光值(荧光值21b、…、荧光值21n)未超过检测极限值的情况，向步骤206移动。
在步骤206中，将以放大率a放大的第f第i循环的全部的荧光值；荧光值2Qa 从存储器36删除，该放大率a是与在上述步骤202中判定为超过了检测极限值的荧光值21a 对应的放大率。另外，在下一步骤208中，将存储于R0M32中的放大率的设定中的放大率a 的设定解除。
当经由上述步骤206而向步骤210移动时，由于荧光值；荧光值2Qa已经被删除， 因此存储于存储器36的荧光值中的在第21循环检测到的最大的荧光值成为荧光值21b。因此，在显示操作部24上显示荧光值lb 荧光值21b作为检测结果。
并且，经由步骤122、110而返回步骤102，重复进行PCR的下一循环的处理。此时， 在下一步骤200中，由于在上述步骤208中将放大率a的设定解除，因此不再从CPU30向多路选择器18输入用于选择放大率a的选择信号，停止以放大率a放大的荧光值的取得。
通过重复进行上述处理，而在上述步骤122中判定为i=k时，结束处理。例如，在第50循环中当荧光值5(lb未超过检测极限值时，在上述步骤210中显示的检测结果的一例如图13所示。由于以最大的放大率a放大的荧光值超过了检测极限值，因此将以其下面大的放大率即放大率b放大的荧光值lb 荧光值显示作为检测结果。
另外，在上述步骤204中，判定为检测极限值以下的荧光值不存在而向步骤212移动时，结束PCR，将未正常取得荧光值的内容的消息显示在显示操作部24上等而通知异常， 结束处理。
如以上说明那样，根据第二实施方式的核酸检测装置，在每I循环切换放大率并取得以多个放大率放大的荧光值，因此即使在取得的荧光值的电平难以预测时也能够应对，能够削减存储器容量。另外通过将以多个放大率中的最适当的放大率放大的荧光值、例如未超过装置的检测极限值的荧光值中的最大的荧光值作为检测结果，而能够高精度地检测被放大了的目标核酸的量。能够自动地设定这种放大率。另外，放大反应、融解温度测定中，测定自身花费的时间长，因此即使放大率的切换需要些许的时间，对测定时间整体的影响也小。
需要说明的是，在第二实施方式中，说明了基于实时PCR的放大反应的情况，但在目标核酸的融解温度测定中也能够适用本发明。这种情况下，可以不是每个循环，而在成为测定点的每个温度(例如，每l°c)下，切换放大率并检测多个荧光值。
另外，在第二实施方式中，说明了将以与超过了装置的检测极限值的荧光值对应的放大率放大的到当前循环为止的荧光值全部删除，且在以后的循环中不取得以该放大率放大的荧光值的情况，但并未限定于此。例如，若存储器容量具有富余度，则可以不删除到目前为止取得的荧光值，而仅停止在以后的循环中的荧光值的取得。另外，也可以基于在从测定开始起的规定循环中所检测到的荧光值，将规定的阈值以下的荧光值删除，并在以后的循环中将成为该规定的阈值以下的荧光值所对应的放大率的设定解除。由此，能够进一步削减存储器容量。
另外，在第二实施方式中，说明了在显示检测结果时显示将检测到的荧光值直接标绘的图形的情况，但并未限定于此。例如，也可以通过对每个循环检测到的离散的荧光值进行平滑化、基线校正，来校正为平滑的图形而进行显示。
另外，在第二实施方式中，说明了使用在杂交至目标核酸的目标序列的区域时发出荧光且在未杂交至目标序列的区域时减小荧光强度的探针的情况，但并未限定于此。也可以使用在未杂交至目标核酸的目标序列的区域时发出荧光且在杂交至目标序列的区域时减小荧光强度的探针。
另外，在第二实施方式中，说明了随着放大反应进展而荧光值增加的反应系统，但也可以适用于随着放大进展而荧光值下降的反应系统。
另外，在上述第一及第二实施方式中，说明了将放大反应作为实时PCR的情况，但并未限定于此，也可以是LAMP法、侵入法、RT-PCR等。另外，检测到的光并未限定为荧光， 根据检体的种类、放大反应的方法，例如也可以检测红外光等。
另外，在上述第一及第二实施方式中，说明了设置放大率不同的多个放大电路的情况，但也可以在I个放大电路中切换为不同的多个放大率。例如，可以将I个放大电路 16形成为图14所示的结构。该放大电路16的放大率为1+R1/R2，且R1=R11+R12+R13+… +Rln。因此，为了成为用于得到所希望的放大率的电阻值R1，而通过来自CPU的选择信号， 对与电阻R12、R13、…、Rln并联连接的开关的接通断开进行控制即可。需要说明的是，在上述第一及第二实施方式中，将多个放大电路16a 16η汇总的结构是本发明的放大单元的一例，在图14的例子中，I个放大电路16为本发明的放大单元的一例。
另外，在上述第一及第二实施方式中，说明了将检测结果显示在显示操作部上的情况，但也可在核酸检测装置上设置打字装置而将检测结果向纸等介质打字输出，也可以记录在移动式记录介质上，还可以向经由网络而连接的外部装置输出检测结果。
需要说明的是，也可以将对上述的核酸检测处理例程进行了规定的程序记录在记录介质上来提供。
权利要求
1.一种核酸检测装置，其包括 检测单元，其在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量； 放大单元，其将由所述检测单元检测到的电信号以规定的放大率放大；及 控制单元，其以如下方式进行控制基于在所述放大反应或融解温度测定的初始阶段中由所述检测单元检测到的电信号、及装置的检测极限值，变更在所述初始阶段之后的放大反应或融解温度测定时所检测到的电信号的放大率。
2.根据权利要求I所述的核酸检测装置，其中， 所述检测单元检测具有随着所述放大反应或融解温度测定进展而电平下降的特性的电信号。
3.根据权利要求I或2所述的核酸检测装置，其中， 在所述放大反应或融解温度测定中使用可杂交至所述目标核酸的目标序列的区域的探针。
4.根据权利要求3所述的核酸检测装置，其中， 所述探针在未杂交至所述目标序列的区域时发出荧光且在杂交至所述目标序列的区域时荧光强度减小。
5.根据权利要求广4中任一项所述的核酸检测装置，其中， 所述控制单元在所述初始阶段由所述检测单元检测到的电信号的电平超过预先确定的范围时，进行对所述放大反应或融解温度测定的异常进行通知的控制、及使所述放大反应或融解温度测定停止的控制或不变更所述放大率的控制中的至少一种控制。
6.一种核酸检测装置，其包括 检测单元，其在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量； 放大单元，其将由所述检测单元检测到的电信号以不同的多个放大率放大；及 控制单元，其以如下方式进行控制在所述多个时刻的每一时刻，切换所述放大单元的放大率来取得以所述不同的多个放大率分别放大的多个电信号。
7.根据权利要求6所述的核酸检测装置，其中， 所述控制单元进行控制以对所取得的多个电信号中的电平为装置的检测极限值以下的电信号进行存储。
8.根据权利要求6或7所述的核酸检测装置，其中， 所述控制单元进行控制以显示所取得的多个电信号中的电平为装置的检测极限值以下、且以与在当前时刻为最大值的电信号对应的放大率放大的电信号在各时刻下的电平。
9.根据权利要求6 8中任一项所述的核酸检测装置，其中， 所述控制单元进行控制以在下一时刻以后不取得以与超过了装置的检测极限值的电信号对应的放大率放大的电信号。
10.根据权利要求6、中任一项所述的核酸检测装置，其中， 所述控制单元在所取得的多个电信号全部超过了装置的检测极限值时，进行对所述放大反应或融解温度测定的异常进行通知的控制、及使所述放大反应或融解温度测定停止的控制中的至少一种控制。
11.根据权利要求f10中任一项所述的核酸检测装置，其中， 所述目标核酸的放大反应是实时PCR。
12.—种核酸检测方法，其中， 在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量， 将检测到的电信号以规定的放大率放大， 基于在所述放大反应或融解温度测定的初始阶段中检测到的电信号、及装置的检测极限值，变更在所述初始阶段之后的放大反应或融解温度测定时检测到的电信号的放大率。
13.一种核酸检测方法，其中， 在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻，利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量， 将检测到的电信号以不同的多个放大率放大， 在所述多个时刻的每一个时刻，切换将检测到的电信号放大的放大单元的放大率，来取得以不同的多个放大率分别放大的多个电信号。
14.一种核酸检测程序，其用于使计算机作为控制单元发挥作用，所述控制单元以如下方式进行控制 检测单元在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量，放大单元以规定的放大率放大由所述检测单元检测到的电信号， 对于作为所述放大单元的放大率的、在所述放大反应或融解温度测定的初始阶段之后的放大反应或融解温度测定时检测的电信号的放大率，基于在所述初始阶段中由所述检测单元检测到的电信号、及装置的检测极限值来进行变更。
15.一种核酸检测程序，其用于使计算机作为控制单元发挥作用，所述控制单元以如下方式进行控制 检测单元在目标核酸的放大反应或融解温度测定的多个时刻利用与根据该目标核酸的量而产生的光量对应的电平的电信号来检测放大或融解的目标核酸的量，放大单元以不同的多个放大率放大由所述检测单元检测到的电信号， 切换放大单元的放大率，来取得通过所述放大单元以所述不同的多个放大率分别放大的多个电信号。
全文摘要
一种核酸检测装置、方法、及程序，设定用于高精度地检测放大或融解的目标核酸的量的适当的放大率。利用光源(12)对反应液照射激励光，从而由受光部(14)来接受与由PCR放大的目标核酸的量相对应而产生的荧光，利用放大率不同的多个放大电路(16a~16n)将与接受到的荧光量对应的电平的电信号放大，利用多路选择器(18)选择以放大反应的初始阶段的放大率(例如，1倍)放大的电信号，检测在该循环的荧光值。通过CPU(30)从初始阶段的荧光值取得最大值，将调整阶段的放大率决定为“(装置的检测极限值-容限)/初始阶段的荧光值的最大值”，向多路选择器(18)输入用于选择以所决定的放大率放大的电信号的选择信号。在调整阶段中，选择以所决定的放大率放大的电信号，检测荧光值。
文档编号C12M1/36GK102978107SQ20121032033
公开日2013年3月20日 申请日期2012年8月31日 优先权日2011年9月2日
发明者平野胜靖 申请人:爱科来株式会社