一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物 的方法，是一种在常温等温条件下，对多个核酸目标物同时进行快速、实时、特异性检测的 方法，可在体外临床检测、食品安全、生物安全以及农业领域具有广阔的应用前景。
【背景技术】
[0002] 核酸等温扩增技术是一类分子生物学技术的总称，它们能在某一特定温度下保持 恒定，实现特定DNA或RNA片段拷贝数快速增加的过程。在核酸扩增技术领域里，以聚合酶 链式反应（PCR)为代表的核酸非等温扩增技术，在过去的20年里，已在疾病的临床诊断方 面，以其快速、灵敏和特异的优势，日益取代了传统的诊断方法，并也使一些之前无法完成 的诊断成为可能。以微生物病原体的诊断为例，传统的金标法培养法与后续发展的免疫检 测法，都存在检测时间过长、操作繁琐、以及灵敏性与特异性一般等缺点。但是PCR扩增可 将原本需要几天，甚至半个月才获得结果的检测流程简化至1-2天，给临床诊断检测领域 带来了质的飞越。
[0003] 由于PCR是以物理反复式变温方式不断产生线性DNA模板进行扩增与复制，因此， 其注定需依赖温度循环仪（thermocycler)实现检测。相比而言，核酸扩增技术的新分支， 核酸等温扩增技术则具有更大的优势。因为此类扩增反应的全过程均在同一温度条件下进 行，使对仪器的精密程度要求大大简化，反应时间也相应明显缩短。例如可通过金属浴、水 浴锅、甚至是孵育箱或室温即可完成反应，因而它们更能满足现场、临床、突发性或应急性 检测的需求，进而具有更大、更广泛的应用价值。
[0004] 正是基于核酸等温扩增技术的广阔应用前景，世界各国都在此领域进行积极与广 泛的研宄。目前技术成熟且研宄较多的核酸等温扩增技术主要包括以下几种：环介导核酸 等温扩增技术（Loop mediated isothermal amplification, LAMP)，依赖于核酸序列的扩 增技术（NASBA)，滚环扩增技术（RCA)，单引物等温扩增技术（SPIA)，依赖于解旋酶的等温 扩增技术（HDA)，链替换扩增技术（SDA)，自主序列复制系统（3SR)与切刻内切酶核酸恒温 扩增技术（NEMA)。但由于工作原理或引物设计原理的不同，其中仅有NASBA曾在同一反应 管中实现过同时检测两种RNA的表达水平。此外，SDA法则是通过与微芯片技术相结合后， 才实现了多重扩增。因此在同一检测管中，类似荧光定量PCR，通过荧光探针法在常温等温 的条件下实现核酸的多重检测的案例，目前尚未见报道。
[0005] 当前，荧光定量PCR或其多重反应，因具备实时检测、同时检出多项指标、高灵敏 度和准确性等优点，成为体外分子诊断的主要技术之一，被广泛的应用到许多领域，例如临 床疾病诊断、病原菌的检出、出入境动植物的检验检疫等。但是它对精密设备，即荧光定量 PCR仪，的高度依赖性，使其主要集中在中心实验室内使用，未能帮助实验人员真正在现场 实现核酸的快速检测。此外，由于荧光定量PCR仪的高精密性，使得整个实验设置过程相对 复杂，因此不但实验操作，而且结果的解读也都需要受过专业训练的技术人员才能完成。这 些缺点更让荧光定量PCR难以在基层检测实验室或单位推广，因而资源匮乏的边远地区则 更不便于使用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对以上问题提供一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标 物的方法，克服目前荧光PCR对精密仪器的依赖较大，且核酸等温扩增技术的PCR产物定量 不够精确、目前尚不能实现同时检测多个目标物的问题。
[0007] 本发明通过以下技术方案来实现：一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物 的方法，该方法包括以下步骤：
[0008] (1)单链结合蛋白将多个模板双链的母链局部打开成单链；
[0009] (2)重组酶与多对引物结合成复合体，在辅助蛋白的作用下结合到母链上，多个荧 光探针也与互补区域结合，所述的多个荧光探针中部标记有四氢呋喃，四氢呋喃两侧分别 为荧光基团和淬灭基团，荧光基团和淬灭基团之间间距为2-6nt，荧光探针3'末端标记阻 抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团；
[0010] (3)DNA聚合酶结合到引物的3'末端，进行子链的延生；
[0011] (4)核酸外切酶识别双链状态下的多个荧光探针上的四氢呋喃位点，酶切后使荧 光基团和淬灭基团得以分离，释放荧光；
[0012] (5)多个荧光探针被切断后，露出了原本被探针3'末端修饰所封闭掉的3'-OH端， DNA聚合酶可以继续延伸形成子链；
[0013] (6)通过检测扩增曲线的形状，和荧光信号的强弱，可对待测样本进行定性且半定 量检测。
[0014] 进一步的，所述的荧光探针长度为46_52nt。
[0015] 进一步的，所述的荧光探针3'末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团为 C3-spaCer、磷酸基团、生物素、生物素-TEG或胺基中任意一种。
[0016] 进一步的，所述的荧光基团为 的任意一种。
[0017] 进一步的，所述的淬灭基团为BHQl或BHQ2。
[0018] 进一步的，所述的重组酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，辅助蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID No. 2所示，单链结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，DNA聚合酶的氨 基酸序列如SEQ ID No. 4所示，核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0019] 进一步的，所述的恒温条件为25-42度。
[0020] 更详细的，本发明中：
[0021] 多对引物，是针对多个核酸目标物分别设计的多条寡核苷酸，其特征是：每两条 寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在 30-35核苷酸（nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物 Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出，其扩增产物为单一 条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体；多对引物之间也不能相互形成结构牢固的寡 核苷酸双链。
[0022] 多个荧光探针（图1)，是针对多个核酸目标物分别设计的多条寡核苷酸长单链， 其特征是：每条寡核苷酸单链专一性识别一个核酸目标物序列的中部，不与引物特异识别 位点重叠；长度为46-52nt，序列避免回文序列、连续单碱基重复和内部二级结构；共有4 个修饰位点，中部距离5'端约30nt位置标记一 dSpacer，即四氢呋喃（THF)，作为核酸内 切酶识别位点，由于识别位点仅为一个核苷酸，因此设计探针显得更为简单，也便于做多重 检测时的探针设计；THF位点两侧分别标记一个荧光基团与一个淬灭基团，两基团间距为 2-6nt ;3'末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，例如C3-spacer、磷酸基团、生物 素、生物素-TEG或胺基；探针的Tm值不作为设计的主要考虑因素；荧光基团可从FAM、HEX、 JOE、VIC、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中选择，淬灭基团可选择BHQl或BHQ2,以最大限度 地降低背景荧光噪音为原则。
[0023] 重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白、与核酸外切酶，是经基因工程改造 的重组工程酶，包括：1)均来源于天然菌中的有特定功能的活性蛋白，后经基因工程改造； 2)在体外经化学试剂，例如IPTG，或温度的诱导后，在发酵培养的大肠杆菌细胞内可获得 大量表达的目的蛋白；3)细胞破碎后，均经过两次蛋白纯化，例如镍柱纯化与肝素柱纯化， 从而获得高纯度的单一蛋白；4)纯化后，蛋白经过酶活性鉴定测试，从而获得具有高活力 单位的蛋白酶；5)重组酶，负责与引物分别形成起始反应复合物，可从大肠杆菌（E. coli) 重组酶RecA或T4 菌体重组酶uvsX等天然菌中选取；6)单链结合蛋白，负责结合DNA单 链，并稳定解链时所形成的气泡区，可从E. coli或T4的gp32蛋白等天然菌中选取；7)DNA 聚合酶，同时具备聚合活性与链置换活性，可从E. coli的DNA聚合酶I Klenow大片段、Bst 聚合酶、Phi-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)等天然菌中选取；8)辅助蛋白，负责协 助、促进并稳定起始反应复合物与DNA链间的结合，例如可选择T4的uvsY蛋白；9)核酸外 切酶，负责识别探针与子链形成的带有切口的DNA双链，作用于切口处酶切探针，释放荧光 基团的信号以便相应仪器检测到，例如可选择E. coli的核酸外切酶exoIII或exoIV。各种 蛋白的序列详见序列表。
[0024] 其它化学组分，是维持最适反应环境的多种化学成分的混合物，所含组分包括 2-3%聚乙二醇（PEG)、20-30mMTris 碱、90-110mM 乙酸钾（KAc)、4-6mM 二硫苏糖醇（DTT)、 2_3mM 三磷酸腺苷（ATP)、45_55mM 磷酸肌酸二钠盐（PCr，Creatine phosphate disodium salt)、90_110ng/ μ I 磷酸肌酶（CK，Creatine kinase)、200_250uM 脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)、5. 5-6. 5%海藻糖（Trehal