恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测体系统及其检测方法
【专利说明】恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测体系 统及其检测方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术检测领域，特别涉及实时荧光定量PCR检测方法及其检测体 系，适合于鼠类及恙螨等携带的恙虫病东方体的核酸检测工作。
【背景技术】
[0003] 虫媒病是一类重要的传染病。在我国每年传染病总发病病例中约占5 %~10 %， 死亡病例数占传染病总死亡数的30 %~40 %。近年来，全球新发现的30余种传染病中，有 许多是由病媒生物传播的。恙虫病（Tsutsugamushi Disease)又称丛林斑瘆伤寒，是由恙 虫病东方体（Oriewiia 引起的自然疫源性疾病，可引起高热、发瘆等症状， 常可致死。
[0004] 在我国，近年来，恙虫病病例时有发生。迄今为止，我国22个省区均有该病的发生 和流行，疫区不断扩大是当前我国恙虫病疫情的流行趋势。恙虫病东方体的主要媒介昆虫 为恙螨，啮齿动物尤其是鼠类是其主要传染源，恙虫病东方体可长期在鼠类体内保存，故感 染恙虫病的鼠类具有较长的传染期。
[0005] 鼠类是出入境交通工具中常见的媒介生物之一，可随飞机、轮船等载体在国境口 岸之间扩散。近年来，我国卫生检疫机构在北京、上海、宁波、成都等口岸的入境飞机、轮船、 集装箱中查获大量的鼠类。鼠类的输入对我国国境口岸卫生安全构成严重威胁。
[0006] 我国目前有港口、机场、车站及陆路边境口岸约400个，每年均有大量媒介生物借 助交通工具、集装箱及货物等在口岸间输入输出。仅2002年到2007年的五年间，卫生检疫 机构就在入境交通工具、集装箱、货物中共捕获各类病媒生物1. 8亿多只，且捕获数量呈现 逐年上升的趋势。大量媒介生物的输入对我国的卫生安全特别是口岸地区的卫生安全造成 极大的威胁。强化对出入境交通工具及集装箱、货物等的排查和对输入性医学媒介生物携 带病原体的检测，是有效防止虫媒传染病通过国境口岸输入、输出，避免疫情大范围爆发的 基础和前提，也是国境口岸检疫执法和虫媒疾病监测的迫切需要。
[0007] 恙虫病东方体检测方法主要包括Giemsa染色、病原分离、间接免疫荧光试验 (IFA)、分子生物学试验等，由于受样品感染情况、检测者实际操作水平等众多因素的影响， Giemsa染色、病原分离和间接免疫荧光试验（IFA)等检测方法均存在着一定的局限性。随 着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR技术被广泛应用到医学和生物学领域， 该技术具有灵敏度高、特异性好和可靠性强等特点，而且能够实现多重反应，自动化程度 高。TaqMan技术是一种对单管PCR产物进行实时荧光定量检测的技术，通过加入与靶基因 序列特异互补的双荧光标记探针，利用荧光信号的积累来实时监测整个PCR进程，从而对 靶标基因进行定量或定性检测。与常规TaqMan探针相比，美国应用公司推出的TaqMan-MGB 探针技术不仅荧光本底得以降低，荧光光谱分辨率得以改善，由于探针3'端结合了 Minor groove binder结合物，使得探针的Tm值得以提高，同时提高了探针的杂交稳定性和特异 性。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是克服现有恙虫病东方体检测的不足问题，提供一种恙虫病东方体 TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测体系统，包括引物和TaqMan-MGB探针序列，特异性 强；另外本发明还提供一种恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测体方法， PCR反应体系和反应条件，该检测方法特异性强，敏感性高，适合对高恙虫病东方体进行检 测。
[0009] 本发明恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测体系，包括一对引物 及一条TaqMan-MGB探针，引物和探针序列如下： 上游引物 Ot-F : 5 ' -TCTRCRCCAGTAATYATTCCTCC-3 ' R=A/G Y=T/C 下游引物 Ot-R :5' -TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3' 探针 Probe-O :5' -HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3' 其中上游引物在第4位、第6位及第15位存在简并性，同时在扩增区域内设计 Taqman-MGB探针，在探针合成时5'端连接HEX荧光基团。
[0010] 所述检测体系中PCR反应体系如下： TaqMan mix buffer 10 ? Ot-F (10 μΜ) 0.6 μL Ot-R (10 μΜ) 0.6 μL Probe-O (10 μΜ) 0. 6 I^L pMD18-T-〇t 1 μL 补足ddH20到20 μL 其中pMD18-T-〇t是提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAAT TGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATC TGCTCG0
[0011] 本发明恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法： (1) 首先是引物和探针的合成：引物和探针设计步骤如下：1)通过GenBank收集恙虫 病东方体基因序列并进行同源性比对；2)以恙虫病东方体Karp型恙虫病东方体的56-kDa 蛋白基因序列设计引物Ot-F和Ot-R ;3)依据PCR扩增区域内的核酸序列设计特异性的 Taqman-MGB探针序列，并通过GenBank网站比对探针的特异性； (2) 恙虫病东方体阳性对照样品的合成：合成质粒样品，依据GenBank公布的恙虫病东 方体基因序列（GI:63079111)，选取恙虫病东方体引物扩增区域核酸序列（153 bp)，委托宝 生物工程(大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，命名 为pMD18-T-〇t，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAAT TGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATC TGCTCG ； (3) PCR反应体系的建立：以循环阈值和荧光强度等作为评价指标，以不同的引物浓度 (0. 2 PL~1 μυ和探针浓度（0. 2 PL~0. 8 μυ进行配比，优化最佳反应体系如下： TaqMan mix buffer 10 M-L Ot-F (10 μΜ) 0.6 μL Ot-R (10 μΜ) 0.6 μL Probe-O (10 Μ-Μ) 0. 6 M-L pMD18-T-〇t 1 μL 补足 CldH2O 到 20 μL ; (4) 实时荧光定量PCR反应条件优化：通过优化退火温度，最佳PCR反应条件如下： 50〇C 2min ;95°C IOmin ;95°C 15s，60°C lmin，循环 45 次，退火时收集荧光信号。
[0012] (5)检测方法评价：对上述优化的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量 PCR检测方法的反应体系和反应条件进行评价，包括敏感性评价，特异性评价和重复性评 价。
[0013] 所述敏感性评价方法如下：以制备的pMD18-T_0t标准品(浓度梯度为：10^101)为 模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，以Ig (浓度）为横轴，以循环阈值Ct值为纵轴，绘 制恙虫病东方体实时荧光定量PCR定量关系曲线。
[0014] 所述特异性评价方法如下：以莫氏立克次体、普氏立克次体、立氏立克次体、Q热 立克次体、噬吞噬细胞无形体及伯氏疏螺旋体病原体DNA为模板，同时以恙虫病东方体阴 性的鼠类基因组DNA及恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA与pMDIS-T-Ot的混合物作为 阴性对照及阳性对照进行实时荧光定量PCR扩增，对扩增曲线及Ct值进行分析。
[0015] 所述重复性评价方法如下： 以同一批次制备的IO6个拷贝的pMD18-T-〇t标准品做为模板进行实时荧光定量PCR扩 增，获得较理想的扩增曲线，通过对5次扩增结果循环阈值（Ct)及Tm值进行统计学分析； 以不同批次制备的IO3和10 7个拷贝的PMDlS-T-Ot标准品做为模板，进行实时荧光定 量PCR扩增，IO3批间重复性试验及10 7批间重复性试验均获得较为理想的扩增曲线，通过 对5次扩增结果循环阈值（Ct值）进行统计学分析。
[0016] 本发明与同类技术相比，具有显著的优点：本发明以TaqMan探针技术为基础，应 用TaqMan-MGB探针技术设计并合成恙虫病东方体探针，建立恙虫病东方体TaqMan-MGB探 针实时荧光定量PCR检测方法，对恙虫病东方体进行核酸检测，该检测方法操作简便，检测 周期短，特异性强，为国境口岸对恙虫病东方体的快速检测工作提供技术支持。
【附图说明】
[0017] 图1为恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法敏感性试验扩 增曲线，其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度； 图2为恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法敏感性试验定量关 系曲线，其中横轴为标准品拷贝数的对数，纵轴为循环数； 图3为恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性试验扩增曲 线，其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度； 图4为恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法批内重复性试验 (106) 扩增曲线，其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度； 图5为恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法批间重复性试验 (IO3)扩增曲线，其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度； 图6为恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法批间重复性试验 (107) 扩增曲线，其中横轴为循环次数，纵轴为荧光强度。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。
[0019] 实施例1 恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测体系，包括一对引物及一条 TaqMan-MGB探针，引物和探针序列如下： 上游引物 Ot-F : 5 ' -TCTRCRCCAGTAATYATTCCTCC-3 ' R=A/G Y=T/C 下游引物 Ot-R :5' -TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3' 探针 Probe-O :5' -HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3' 其中上游引物在第4位、第6位及第15位存在简并性，同时在扩增区域内设计 Taqman-MGB探针，在探针合成时5'端连接HEX荧光基团。
[0020] 所述检测体系中PCR反应体系如下： TaqMan mix buffer 10 ? Ot-F (10 μΜ) 0.6 μL Ot-R (10 μΜ) 0.6 μL Probe-O (10 μΜ) 0. 6 I^L pMD18-T-〇t 1 μL 补足ddH20到20 μL 其中pMD18-T-〇t是提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAAT TGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATC TGCTCG0