家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法
【专利摘要】本发明公开了一种家畜衣原体Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法。该试剂盒根据靶序列上MOMP的一个区域设计两条引物和一条探针，可特异性的扩增家畜衣原体。该试剂盒包括扩增反应液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明只需要两步法扩增法及简单的反应条件就可以快速、高效、特异性、高灵敏度地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。
【专利说明】家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002]动物衣原体病ipilamydiosis)是由各类衣原体{Chlamydia)感染哺乳动物、禽类等动物所发生的一类十分重要的自然疫源性传染病。该病呈地方流行，常造成很大危害及经济损失。衣原体科的最新分类研究表明，衣原体科分为衣原体属{Chlamydia )和嗜衣原体属iChlamydophila)，包括沙眼衣原本{ChlamydiatracAoffiaiis)、猪源衣原体{Chlamydia Swi1S)、鼠沙眼衣原体OiuridarumsKH产嗜衣原体 iChlamydophila aAoriws)、猫嗜衣原体{Chlamydophilafelis~)、家畜靖灰盾、体 ipilamydophila pecorum)、肺炎衣原体{Chlamydophila pneumoniae)和鹤踏热衣原体{Chlamydophila psittaci) 0感染动物的衣原体主要有6种:猪源衣原体、猫衣原体、家畜衣原体、肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体。家畜衣原体属于嗜性衣原体属。目前已经从牛、绵羊、山羊、考拉和猪分离到该菌。考拉感染家畜衣原体后引起不育症和尿道疾病；其他动物感染后会引起流产、结膜炎、脑脊髓炎、肠炎、肺炎等疾病。家畜衣原体首次从间歇性脑脊髓炎病牛分离出来。C常发现于健康小反会动物如绵羊肠道(Clarkson M.J.等，1997),但有些分离株与结膜炎、关节炎和睾丸炎有关(Rodolakis A..等，1989;StorZ J..等，1968)。猪C peco/Yffl?感染引发肺炎、多发性关节炎、胸膜炎、心包炎和流产。沙眼衣原体和C 混合感染可能是猪衣原体流产的主要原因。由此可见家畜衣原体对养殖业有着很大的危害，对养殖业的发展造成极大的威胁。本发明就此研究开发了家畜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，这种方法能够快速准确的检测到家畜衣原体，在最短的时间内做出相应的对策。
`[0003]TaqMan探针是一种募核昔酸探针，突光基团链接在探针的5’末端,洋灭基团则在3，端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有高特异性与高敏感性。
[0004]TaqMan — MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基团，本身不会发生荧光，这样就降低了 PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感性。
[0005]中国发明专利(申请号为:200710030435.0,200710030437.X,200710132320.2、200710026389.7,200810052321.0,200810015001.8,200810093986.6,200910041358.8、200910251055.9,200910090037.7,201010555073.9,201110339104.X 等)分别公开了采用
荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术检测家畜衣原体{C.pecorum)的试剂盒及检测方法的报道。
【发明内容】
[0006]为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种家畜衣原体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，第二个目的是提供使用该引物的家畜衣原体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的使用方法，用于对肉食品出入境进行检测。
[0007]为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案:家畜衣原体Taqman — MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，包括家畜衣原体上游引物，其DNA序列为SEQ ID N0.1 ;家畜衣原体下游引物，其DNA序列为SEQ ID N0.2 ;家畜衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQ IDN0.3。
[0008]为了实现上述第二目的本发明采用如下技术方案:一种家畜衣原体荧光实时定量PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中:
所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成:
DNA序列为SEQ ID N0.1的10 μ mol/L的家畜衣原体上游引物0.2 μ L ;
DNA序列为SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的家畜衣原体下游引物0.2 μ L ;
DNA序列为SEQ ID N0.3的10 μ mol/L的猪家畜衣原体MGB探针0.4 μ L ;
2 X Premix Ex Taq 缓冲液` 10 μ L ;
灭菌去离子水8.2μ L ;
所述阳性对照管，管内为家畜衣原体阳性重组质粒DNA，体积为20 μ L ;
核苷酸序列为SEQ ID N0.4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒 DNA;
所述阴性对照管，管内为无家畜衣原体感染的猪的血液基因组DNA，体积为20μ L ; 所述灭菌去离子水管ImL~2mL。
[0009]为了实现上述第二目的本发明提供一种家畜衣原体荧光实时定量PCR检测方法:包括如下步骤:
O制备待检模板DNA:选用商品化的DNA提取试剂盒，提取待测样品中的DNA，获得待检模板DNA ；
2)扩增反应体系为:19μ L扩增反应液，I μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20 μ L;
3)家畜衣原体荧光定量PCR扩增:将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR管反应条件:预变性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s~34s (使用ABI 7500建议采用34s) 40个循环；在58°C 30s进行荧光信号的采集。
[0010]4)结果判定:将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
[0011]本发明的原理是:针对一段1000bp左右的靶序列上MOMP保守区域设计2条引物和一条MGB探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基团FAM, 3’端标记有非淬灭基团,本身不产生突光,可以大大降低本低信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，可以将MGB探针设计的更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率大为提高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。
[0012]TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测。现有的家畜衣原体的检测周期较长，约I天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需50min左右。
[0013]本发明的优点是(I)、不需要特殊试剂与设备；(2)、高特异性:应用MOMP的保守区段，二条引物及一条MGB探针，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.8%，假阳性率小于0.1% ; (3)、快速、高效扩增:检测时间50min左右；(4)、灵敏度高:最低检测极限达到2.8X 10拷贝/uL ; (5)、鉴定简便:通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精确的，无需电泳等其他任何分析步骤；(6)、用途:可用于畜产品及其相关产品的快速检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1特异性试验结果 图2灵敏度试验结果；
图3稳定性试验结果；
图4标准曲线的建立；
图1中:分别采用了家畜衣原体菌株VR-1575，肺炎衣原体菌株53592，流产衣原体菌株VR-656,鹦鹉热衣原体，沙眼衣原体菌株VR-878，小鼠衣原体VR-123，猫衣原体，阴性对照。
【具体实施方式】
[0015]实施例1，引物的设计及筛选
家畜衣原体荧光定量PCR扩增引物及探针，其设计是根据GenBank公布的家畜衣原体MOMP基因的参考序列，用MEGA5进行比对，分析序列并在其保守区域进行引物与探针的设计。采用探针设计软件Primer Express 3.0,设计4套突光定量引物，由英骏(上海)有限公司合成，利用ABI 7500 FAST PCR仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一组荧光定量PCR扩增引物，分别标记为SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.3。其中引物组中上游引物:SEQ ID N0.1 ;下游引物:SEQID N0.2 ;探针:SEQ ID N0.3 ；SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.3 的浓度分别为 10 μ mol/L, 10μ mol/L ,10 μ mol/L，体积比为1: 1: 2。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其核苷酸序列分别为=PCR上游引物:SEQ ID N0.4 ；PCR下游引物:SEQ ID N0.5 ；它们的体积比为1:1。
[0016]SEQ ID N0.1 代表的序列为:5’ -GCAGAGCCAAGTTTATTAATTG-3’
SEQ ID N0.2 代表的序列为:5’ -TAGCGCAAGGATCACATG-3’
SEQ ID N0.3 代表的序列为:5’ FAM-ATCTCCTGACATACCTTC-MGB3’
SEQ ID N0.4 代表的序列为:5’ -CTCCTTRCAAGCYYTGCCTGT-3’
SEQ ID N0.5 代表的序列为:5’ -GTGAGCWGCTCTTTCRTYRATTAARCG-3’
实施例2，阳性对照品的制备
用试剂盒提取家畜衣原体细胞培养物的核酸，将其核酸进行PCR及电泳鉴定，采用PCR上游引物SEQ ID N0.4和PCR下游引物SEQ ID N0.5进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1:10的比例和PMD19-T载体进行连接反应，4°C连接过夜，转化DH5a菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的OD值，使其260/280的比值在1.8~2.0之间。
[0017]实施例3，阴性对照品的制备
用试剂盒提取无家畜衣原体感染的猪的血液基因组DNA，进行PCR及电泳鉴定。
[0018]实施例4，家畜衣原体荧光定量PCR扩增快速检测方法:包括如下步骤:
O制备待检模板DNA:选用商品化的DNA提取试剂盒，提取样品中的DNA，获得待检模板 DNA。
[0019]2)扩增反应体系为:19 μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20 μ L。
[0020]3)家畜衣原体荧光定量PCR扩增:将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件:预变性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s (使用ABI 7500建议采用34s) 40个循环；在58°C 30s进行荧光信号的采集。
[0021]4)结果判定:将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
[0022]实施例5，猪衣原体荧光定量PCR扩增的特异性试验
采用实施例4中的反应体系及反应条件进行特异性的试验，所采用的模板分别是家畜衣原体菌株VR-1575，肺炎衣原体菌株53592，流产衣原体菌株VR-656，鹦鹉热衣原体，沙眼衣原体菌株VR-878，小鼠衣原体VR-123，猫衣原体，阴性对照。
[0023]参见图1的结果显示:图中的两条曲线分别表示只有VR-1575株家畜衣原体菌有检测结果。
[0024]实施例6，家畜衣原体荧光定量PCR扩增的灵敏度试验
将所建立的家畜衣原体质控标准品(即阳性质粒)进行10倍倍比稀释(2.8X IO8拷贝/μ L^2.8X10拷贝/y L)，采用实施例4的反应体系及反应条件进行灵敏度试验，结果显示出，建立的该方法最低能够检测出2.8 X 10拷贝/ μ L的DNA样品。
[0025]参见图2的结果显示:图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依次分别为 2.8 X IO8 拷贝 / μ L、2.8 X IO7 拷贝 / μ L、2.8 X IO6 拷贝 / μ L、2.8 X IO5 拷贝 / μ L、2.8Χ104 拷贝 / μ L、2.8Χ103 拷贝 / μ L、2.8X IO2 拷贝 /yL、2.8X10 拷贝 /yL。
[0026]实施例7，家畜衣原体荧光定量PCR扩增的重复性试验
以重组质粒标准品2.8X106拷贝/yL与2.8X105拷贝/ μ L为模板，采用实施例4的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数为 0.1702%~2.796%，表明该方法具有较好的重复性。
[0027]参见图3的结果显示。
[0028]实施例8，家畜衣原体荧光定量PCR扩增的标准曲线的建立
把重组质粒的标准品进行五个倍比稀释，进行标准曲线的制作，以荧光强度的对数值为横坐标，循环数为纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数R2=0.999，扩增效率达到101.7%, Υ=3.2815Χ+41.396。由此可见本实验所建立的标准曲线的扩增效率较好，其荧光曲线与所检测的靶基因浓度之间的相关性较好，准确度较高。
[0029]参见图4的结果显示。`
【权利要求】
1.家畜衣原体Taqman— MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物，其特征在于:包括家畜衣原体上游引物，其DNA序列为SEQ ID N0.1 ； 家畜衣原体下游引物，其DNA序列为SEQ ID N0.2 ； 家畜衣原体MGB探针，其DNA序列为SEQ ID N0.3。
2.家畜衣原体Taqman— MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于:它包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中: 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成: DNA序列为SEQ ID N0.1的10 μ mol/L的家畜衣原体上游引物0.2 μ L ; DNA序列为SEQ ID N0.2的10 μ mmol/L的家畜衣原体下游引物0.2 μ L ; DNA序列为SEQ ID N0.3的10 μ mol/L的家畜衣原体MGB探针0.4 μ L ; 2XPremix Ex Taq 缓冲液 ΙΟμ?; 灭菌去离子水8.2μ L ; 合计19 μ L,为单次反应的用量； 所述阳性对照管，管内为家畜衣原体阳性重组质粒DNA，体积为20μ L ; 所述阴性对照管，管内为无家畜衣原体感染的猪的血液基因组DNA，体积为20μ L ;` 所述灭菌去离子水管ImL~2mL。
3.根据权利要求2所述家畜衣原体Taqman— MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于:所述阳性重组质粒DNA由如下反应获得: 核苷酸序列为SEQ ID N0.4的PCR上游引物和序列为SEQ ID N0.5的PCR下游引物按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。
4.根据权利要求2所述家畜衣原体Taqman— MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于:所述DNA序列为SEQ ID N0.3的家畜衣原体MGB探针的5’端标记有报告基团FAM，3’端标记有非淬灭基团，同时还连接有MGB修饰基团。
5.利用权利要求2所述试剂盒进行家畜衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测的非疾病诊断目的的检测方法:包括如下步骤: O制备待检模板DNA:选用商品化的DNA提取试剂盒，提取待测样品中的DNA，获得待检模板DNA ； 2)扩增反应体系为:19μ L扩增反应液；I μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为20 μ L; 3)家畜衣原体荧光定量PCR扩增:将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件:预变性95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 30s~34s 40个循环；在58°C 30s进行荧光信号的采集； 4)结果判定:将扩增反应在35个循环以内及扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
【文档编号】C12N15/11GK103555841SQ201310540047
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】杨俊 , 聂福平, 王昱, 李应国, 王国民, 袁曾壮 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心