专利名称：Mgb探针多重荧光定量pcr检测大肠杆菌o157的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的检测方法，特别是一种MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌O157的方法。
背景技术：
大肠杆菌O157是一种致病力很强的肠道致病菌，主要引起人和动物的出血性肠炎、溶血性尿毒综合征而致较强的死亡率。大肠杆菌O157的感染剂量较低，每克感染载体含菌10个以上即可能引起感染，甚至导致人的死亡。因此，急需建立一种快速、敏感的检测方法。我国现行食品中检测O157的行业标准是采用经典的选择分离培养、生化试验和血清学的方法，全过程需4--6天，耗时长、操作繁琐，不能满足及时、快速、正确评价食品微生物的安全性要求，养殖和进出口企业的生产需要。
大肠杆菌O157特异性基因的检测是鉴定大肠杆菌O157的必需指标。rfbE基因编码大肠杆菌O157的特异性表面抗原脂多糖，针对rfbE基因设计引物，可检测大肠杆菌O157脂多糖，Desmarchelier等人根据rfbE基因设计了一对特异性很高的引物，所有大肠杆菌O157:H7，O157:H7-菌株PCR反应都为阳性，其他任何菌株则为阴性。Vero毒素是大肠杆菌O157的主要毒力因子之一，现已证实VT毒素与溶血性尿毒综合征相关。VT有VT1和VT2，VT2对人的肾脏微血管内皮细胞的细胞毒性作用比VT1强1000倍，因此将VT2基因作为O157的毒力指标。
经对现有技术文献的检索发现，运用实时荧光定量PCR方法快速检测大肠杆菌O157:H7，详见(Ken J.Yoshitomi，Karen C.Jinneman，StephenD.Weagant，以uid为靶基因3‘小沟结合-DNA探针荧光定量PCR快速鉴定大肠杆菌O157:H7的优化，[分子和细胞探针])(Ken J.Yoshitomi，KarenC.Jinneman，StepheD.Weagant，optimization of a 3’-minor groovebinder-DNA probe targeting the uid gene for rapididentification of Escherichiacoli O157:H7 using real-time PCR[J].MOLECULARAND CELLULAR PROBES.2003，17275-280)。此文未能运用荧光定量PCR方法来对样品进行定量，另外，以上方法只能单一确定细菌的血清型，不能检测出是否含有重要的毒力因子。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌O157的方法。使其所使用MGB探针具有很高的敏感性和特异性，同时，检测AT含量高的序列更为方便，可同时检测大肠杆菌O157的两个特异性基因。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明设计合成rfbE、vt2引物和Taqman-MGB探针，分别用rfbE、vt2引物进行PCR扩增，获得两个目的片断，将目的片断分别与PMD 18-T Vector连接，得到重组质粒，将重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，扩大培养，提取高浓度的重组质粒，将此高浓度质粒作10倍比稀释，作为标准样品，将标准样品和待测样品共同作二重荧光定量PCR，标准样品形成标准曲线，根据标准曲线计算出待检样品中大肠杆菌O157的含量。
此二重荧光定量PCR方法检测拷贝数在100-1010范围内的样本都具有较好的动力学范围，拟合度在0.99以上；在100-1010内重复性好，intra-assayCT值标准偏差(SD)0.07-2.07，变异系数(CV)0.005-0.06之间，inter-assay CT值标准偏差(SD)0.76-1.21，变异系数(CV)0.005-0.09；每个反应体系能检测到100个细菌；具有很强的特异性(十株阳性菌，检测结果均为阳性；50株阴性菌，检测结果均为阴性)；荧光定量PCR结果和细菌计数结果能较好的吻合。
MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌O157的方法，具体步骤如下①设计、合成引物和Taqman-MGB探针通过比对几株大肠杆菌O157rfbE基因和vt2基因的保守区，找出保守序列，设计引物和Taqman-MGB探针，rfbE探针用FAM荧光报告基团标记，vt2探针用ViC荧光报告基团标记，探针的淬灭基团为IFQ(非荧光淬灭基团)，3‘端连接有MGB分子。
②PCR扩增rfbE、vt2基因，获得目的片断，PCR产物切胶回收；③构建重组质粒，将目的片断和PMD 18-T Vector连接，连接后转化DH5 α感受态大肠杆菌细胞，扩大培养，提取质粒，PCR和EcoRI、PstI酶切鉴定目的片断是否已插入PMD 18-Tvector。
④二重荧光定量PCR反应体系和反应条件的确立通过反复实验，确定最优化的反应体系和循环条件⑤建立标准曲线，以5个稀释度的重组质粒作为标准样品建立标准曲线。同时，对样品进行处理，处理后提取基因组DNA作二重荧光定量PCR，根据荧光定量PCR的结果，计算原始样本中大肠杆菌O157的含量。
所述的引物，是指其序列为rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata ta所述的Taqman-MGB探针，是指其序列为rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaarfbE探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记Taqman-MGB基团vt2探针的5′端标记ViC荧光报告基团，3′端标记Taqman-MGB基团。
所述的二重荧光定量PCR，其反应体系如下Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 1ul(终浓度为0.5uM)rfbE-R 1ul(终浓度为0.5uM)vt2-F 0.8ul(终浓度为0.4uM)vt2-R 0.8ul(终浓度为0.4uM)Probe-rfbE 0.6ul(终浓度为0.3uM)Probe-vt2 0.6ul(终浓度为0.3uM)水 3.2ul模板 2ul。
所述的二重荧光定量PCR，其反应体系的反应条件为94℃预变性4min94℃变性30s56℃退火30s60℃伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles。
所述的样品，待检时，用碱裂解法提取基因组DNA具体步骤如下取过夜培养的细菌液3ml，12000rpm，5min；沉淀用567ul的TE(PH 8.0)重悬，加入30ul 10％SDS 和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混匀，60℃水浴20min；加入l00ul 5mol/LNacl溶液，充分混匀，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混匀，60℃ 水浴20min；加入780ul酚氯仿，混匀，12000rpm，10min；将上清液移入一个新管中。重复上一步；取400ul上清至一个新管中；加入400ul氯仿，混匀，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入两倍体积冰冷的乙醇，混匀，-20℃ 放置30 min，12000rpm，20min，沉淀用70％乙醇洗三次，37℃温箱干燥，沉淀用100ul水溶解。
在本发明中，术语“探针”，是指一种寡核苷酸探针，它设计为与目的序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光报告基团连接在探针的5′端，而淬灭剂则在3′端，当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3′端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5′外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号，所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片断一样，有一个同步指数扩增的过程，信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
探针与目标基因扩增产物特异性杂交保证了扩增过程中荧光的特异性，“淬灭”，当探针未结合时，其结构完整，报告基团被激发时产生的荧光能量通过荧光共振能量传递，被邻近的淬灭基团所吸收。
Taqman-MGB探针，在探针3′端连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团-二氢环化吲哚卟啉-三肽(DPI3)，DPI3可折叠进入探针末端5-6bp核苷酸形成的小沟内，形成极为稳定的异源双链。
在本发明中，“FAM荧光报告基团”是指六-羧基荧光素，标记在探针5′端，ViC荧光报告基团是PE Applied Biosystems专有的荧光染料，标记在探针5′端.
在本发明中，“标准品”是指已知拷贝数的重组质粒DNA，用分光光度计测定其OD值，当OD值在0.3左右时，此时测得的结果较可信，每管测三次，取平均值，计算重组质粒拷贝数。
荧光定量PCR定量的依据。特定的待扩增基因起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片断的含量是一样的。理想的扩增结果是Y＝X*2n.其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体系中的原始模板数，n.为扩增次数，理论上PCR扩增效率为100％，但实际上，DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中模板不是呈2的倍数增长，实际应为Y＝X*(1+E)nE代表扩增效率，E＝参与复制的模板/总模板。通常E≤1，通常X在1-105拷贝，循环次数n≤30时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期。
PCR扩增通式Tn＝T0(1+E)n。设定PCR到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧光依赖某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，为常数，大约在1010左右)高于背景为仪器所识别，此时的循环数为cp，也就是k＝T0(1+E)cp。取对数即1gK＝1gT0+cp*lg(1+E)Cp＝-1*1gT0/lg(1+E)+1gK/lg(1+E)对于某特定的PCR而言，E与k均为常数，故上式为循环数(cp)对原始模板拷贝数对数(lgT0)一次方程，其标准形式Y＝kx+b，也是荧光定量PCR的标准曲线。
本发明使用外参照物作定量PCR，以已知浓度的目的基因为模板，按一定的倍比稀释，然后作出标准曲线图，未知的样本按标准曲线找出对应的拷贝数。
荧光阈值通常以10-15个循环的荧光值作为阈值。
CT值扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环次数。
本发明具有更高的敏感性和特异性，能快速、准确地检测样本中的大肠杆菌O157含量，可同时检测大肠杆菌O157的两个特异性毒力基因，是一种快速、准确的大肠杆菌O157检测方法。本发明所使用MGB探针进行荧光定量PCR，MGB探针是指带有一个小沟结合物基团的DNA探针，它可与单链的靶DNA形成极为稳定的异源双链。其优越性表现在1.背景荧光低，由于MGB探针报告基团与淬灭基团的距离较近，具有更好的淬灭效果，另外，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。2.提高Tm值，平均15bp可提高18℃，这样可以使探针的长度更短，尤其对AT含量高的序列，且提高配对与非配对模板间的Tm值差异，即提高了特异性，可进行多重PCR。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，下列事实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook分子克隆，或按照厂商所建议的条件。
实施例一1设计，合成rfbE、vt2引物和探针引物序列是rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata taTaqman-MGB探针序列为rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaa2 rfbE、vt2基因的克隆根据设计的rfbE、vt2引物，分别扩增rfbE、vt2目的基因，PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，再用琼脂糖凝胶成像分析系统分析，在大约100bp和150bp处有可见目的条带。从PCR产物中回收目的基因。
3标准样品的制备
DH5α感受态大肠杆菌细胞的制备从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；取2ml菌液转接到一个含有30ml LB液体培养基锥形瓶中，37℃震荡培养2-3小时，(此时OD600≤0.4-0.5，细胞数＜108/ml)；将细菌转移到Eppendorf管中，冰上放置30min，使培养物至0℃；4℃4000rpm，10min；弃上清，倒置1min；加500ul预冷Cacl2 0.1mol/L重悬细胞，冰上放置30min；4℃4000 rpm，10min；弃上清，倒置1min；用200ul 0.1mol/L Cacl2重悬细胞，冰上放置30min。
4重组质粒的构建将PMD 18-T Vector和目的DNA以1∶3的比例连接，16℃ 11小时，连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌细胞。将已转化的感受态大肠杆菌细胞涂布在含有氨苄青霉素(100ug/ml)的培养基上，37℃培养12-16小时。挑取阳性菌落，于含有氨苄青霉素(100ug/ml)的LB中震荡培养37℃ 12-16小时。用培养的菌液提取质粒，采用PCR和EcR I、pst I酶切鉴定，PCR鉴定结果100bp和150bp处有可见的目的条带。酶切鉴定结果150bp和200bp处有可见的目的条带。可以确定目的片断已插入PMD 18-T Vector，将提取的质粒作10倍比稀释，测OD值，取平均值，计算拷贝数。
实施例二1临床样本的预增菌将1克肉样剪碎，将1克肉样剪碎，放入9毫升含新生霉素(20mg/ml)的改良肉汤中，37℃，200rpm，振荡8 h。
2基因组DNA的提取取振荡培养的细菌液3ml，12000rpm，5min；沉淀用567ul的TE(PH 8.0)重悬，加入30ul 10％SDS 和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混匀，60℃ 水浴20 min；加入100ul 5mol/LNacl溶液，充分混匀，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混匀，60℃ 水浴20min；加入780ul酚氯仿，混匀，12000rpm，10min；将600ul上清液移入一个新管中。重复上一步；取400ul上清至一个新管中；加入400ul氯仿，混匀，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入两倍体积冰冷的乙醇，混匀，-20℃放置30min，12000rpm，20min，沉淀用70％乙醇洗三次，37℃温箱干燥，沉淀用100ul水溶解，即可得到细菌基因组DNA.
3 PCR体系的优化Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 1ul(终浓度为0.5uM)rfbE-R 1ul(终浓度为0.5uM)vt2-F 0.8ul(终浓度为0.4uM)vt2-R 0.8ul(终浓度为0.4uM)Probe-rfbE 0.6ul(终浓度为0.3uM)Probe-vt2 0.6ul(终浓度为0.3uM)水 3.2ul模板 2ul4最佳的反应条件为94℃预变性4min94℃变性30s56℃退火30s60℃延伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles.
5根据荧光定量PCR结果，计算细菌原液的浓度-X(copies/ul)根据基因组提取以及荧光定量PCR的过程，可推导出以下公式(X*3000*300/780)/100＝荧光定量PCR结果(copies/2ul)即X＝(荧光定量PCR结果)*78/1800注公式的说明3000，是指基因组提取过程中，取振荡培养的细菌液3ml，即3000ul。
300，是指基因组提取过程中，吸取上清300ul。
780，是指基因组提取过程中，(567ul的TE，30ul 10％SDS，3ul 20mg/ml蛋白酶K，100ul 5 mol/Lnacl，80 ul CTAB/Nacl，体积一共是780ul)100，是指基因组提取过程中，沉淀用100ul水溶解。荧光定量PCR结果，荧光定量PCR仪会自动显示样品的浓度，单位是copies/2ul。
权利要求
1.一种MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法，其特征在于，设计合成rfbE、vt2引物和Taqman-MGB探针，分别用rfbE、vt2引物进行PCR扩增，获得两个目的片断，将目的片断分别与PMD 18-T Vector连接，得到重组质粒，将重组质粒转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，扩大培养，提取高浓度的重组质粒，将此高浓度质粒作10倍比稀释，作为标准样品，将标准样品和待测样品共同作二重荧光定量PCR，标准样品形成标准曲线，根据标准曲线计算出待检样品中大肠杆菌0157的含量。
2.根据权利要求1所述的MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法，其特征是，具体步骤如下①设计、合成引物和Taqman-MGB探针；②PCR扩增rfbE、vt2基因，获得目的片断，PCR产物切胶回收；③构建重组质粒，将目的片断和PMD 18-T Vector连接，连接后转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，扩大培养，提取质粒，PCR和EcoR I、Pst I酶切鉴定目的片断是否已插入PMD 18-Tvector；④二重荧光定量PCR反应体系和反应条件的确立；⑤建立标准曲线，以5个稀释度的重组质粒作为标准样品建立标准曲线；同时，对样品进行处理，处理后提取基因组DNA作二重荧光定量PCR，根据荧光定量PCR的结果，计算原始样本中大肠杆菌0157的含量。
3.根据权利要求1或者2所述的MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法，其特征是，所述的引物，是指其序列为rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata ta。
4.根据权利要求1或者2所述的MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法，其特征是，所述的Taqman-MGB探针，是指其序列为rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaarfbE探针的5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记Taqman-MGB基团vt2探针的5′端标记ViC荧光报告基团，3′端标记Taqman-MGB基团。
5.根据权利要求1或者2所述的MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法，其特征是，所述的二重荧光定量PCR，其反应体系如下Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 浓度为0.5uMrfbE-R 浓度为0.5uMvt2-F 浓度为0.4uMvt2-R 浓度为0.4uMProbe-rfbE 浓度为0.3uMProbe-vt2 浓度为0.3uM水 3.2 ul模板2ul。
6.根据权利要求5所述的MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法，其特征是，所述的二重荧光定量PCR，其反应体系的反应条件为94℃预变性4min94℃变性30s56℃退火30s60℃延伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles。
7.根据权利要求1或者2所述的MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌0157的方法，其特征是，所述的样品，待检时，用碱裂解法提取基因组DNA具体步骤如下取过夜培养的细菌液3ml，12000rpm，5min；沉淀用567ul的TE(PH 8.0)重悬，加入30ul 10％SDS和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混匀，60℃ 水浴20min；加入100ul 5mol/LNacl溶液，充分混匀，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混匀，60℃ 水浴20min；加入780ul酚∶氯仿，混匀，12000rpm，10min；将上清液移入一个新管中。重复上一步；取400ul上清至一个新管中；加入400ul氯仿，混匀，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入两倍体积冰冷的乙醇，混匀，-20℃ 放置30min，12000rpm，20min，沉淀用70％乙醇洗三次，37℃ 温箱干燥，沉淀用100ul水溶解。
全文摘要
一种MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌O157的方法，构建重组质粒，设计合成引物和Taqman－MGB探针，进行二重荧光定量PCR，将大肠杆菌O157的rfbE、vt2的一段保守序列进行PCR扩增，获得目的片断，再将目的片断与PMD 18－T Vector连接，得到重组质粒，将重组质粒转化DH5a感受态大肠杆菌细胞，扩大培养，获得高浓度的质粒，将此高浓度质粒作10倍比稀释，作为标准样品，将标准样品和待测样品共同作二重荧光定量PCR，标准样品形成标准曲线，根据标准曲线可计算出待检样品中大肠杆菌O157的含量。本发明使用MGB探针，具有更高的敏感性和特异性，能快速、准确地检测样本中的大肠杆菌O157含量，可同时检测大肠杆菌O157的两个特异性毒力基因，是一种快速、准确的大肠杆菌O157检测方法。
文档编号C12Q1/10GK1952647SQ20061002832
公开日2007年4月25日 申请日期2006年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者严亚贤, 朱向玲, 孙建和, 陆承平 申请人:上海交通大学