[0021] 本发明恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法： (1) 首先是引物和探针的合成：引物和探针设计步骤如下：1)通过GenBank收集恙虫 病东方体基因序列并进行同源性比对；2)以恙虫病东方体Karp型恙虫病东方体的56-kDa 蛋白基因序列设计引物Ot-F和Ot-R ;3)依据PCR扩增区域内的核酸序列设计特异性的 Taqman-MGB探针序列，并通过GenBank网站比对探针的特异性； (2) 恙虫病东方体阳性对照样品的合成：合成质粒样品，依据GenBank公布的恙虫病东 方体基因序列（GI:63079111)，选取恙虫病东方体引物扩增区域核酸序列（153 bp)，委托宝 生物工程(大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，命名 为pMD18-T-〇t，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAAT TGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATC TGCTCG ； (3) PCR反应体系的建立：以循环阈值和荧光强度等作为评价指标，以不同的引物浓度 (0. 2 PL~1 μυ和探针浓度（0. 2 PL~0. 8 μυ进行配比，优化最佳反应体系如下： TaqMan mix buffer 10 M-L Ot-F (10 μΜ) 0.6 μL Ot-R (10 μΜ) 0.6 μL Probe-O (10 Μ-Μ) 0. 6 M-L pMD18-T-〇t 1 μL 补足 CldH2O 到 20 μL ; (4) 实时荧光定量PCR反应条件优化：通过优化退火温度，最佳PCR反应条件如下： 50〇C 2min ;95°C IOmin ;95°C 15s，60°C lmin，循环 45 次，退火时收集荧光信号。
[0022] (5)检测方法评价：对上述优化的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量 PCR检测方法的反应体系和反应条件进行评价，检测方法评价包括敏感性评价，特异性评价 和重复性评价。
[0023] 所述敏感性评价方法及结果如下：以制备的pMD 18-T-〇t标准品（浓度梯度为： 10^101)为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，实验结果显示，标准品浓度在108~5. 45 个拷贝时，可获得较为理想的扩增曲线（附图1)。以Ig (浓度）为横轴，以循环阈值Ct值 为纵轴，绘制恙虫病东方体实时荧光定量PCR定量关系曲线（附图2)，其线性拟合系数 R2=O. 9988,说明本发明建立的检测方法满足线性检测应用要求。实验表明，本发明所建立 的多重实时荧光定量PCR检测方法具有较高的敏感性，可检测到5. 45个拷贝数。
[0024] 所述特异性评价方法及结果如下：以莫氏立克次体（R.mooseri)、普氏立克次体 (R. prowazekii)、立氏立克次体（R. brasiliensis)、Q 热立克次体（C. burnetii)、卩莖吞· 细胞无形体（A.phagocytophi)及伯氏疏螺旋体（B. burgdorferi)等病原体DNA为模板， 同时以恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA及恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA与 pMD18-T-〇t的混合物作为阴性对照及阳性对照进行实时荧光定量PCR扩增，对扩增曲线及 Ct值进行分析，本发明的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有 较好的特异性，与上述病原体间无交叉反应(附图3)。实验表明具有较强的特异性，与莫氏 立克次体（R. mooseri)、普氏立克次体（R. prowazekii)、立氏立克次体（R. brasiliensis)、 Q热立克次体（C. burnetii)、吞细胞无形体（A. phagocytophi)及伯氏疏螺旋体 (B. burgdorferi)等均无交叉反应。
[0025] 所述重复性评价方法及结果如下： 以同一批次制备的IO6个拷贝的pMD18-T-〇t标准品做为模板进行实时荧光定量PCR扩 增，获得较理想的扩增曲线（附图4)。通过对5次扩增结果循环阈值（Ct)及Tm值进行统计 学分析，5次试验结果Ct值均值为22. 61，变异系数为1. 49%，变异系数满足统计学应用要 求，本发明的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有较好批内重复 性(表1)。
[0026] 以不同批次制备的IO3和10 7个拷贝的pMDIS-T-Ot标准品做为模板，进行实时荧 光定量PCR扩增，IO3批间重复性试验（附图5)及10 7批间重复性试验（附图6)均获得较为 理想的扩增曲线。通过对5次扩增结果循环阈值（Ct值)进行统计学分析，IO3个拷贝标准 品的5批次重复性试验Ct值均值为33. 05、变异系数为0. 73% ;IO7个拷贝标准品的5批次 重复性试验Ct值均值为15. 15、变异系数为1. 20%，批间重复性试验的变异系数满足统计学 应用要求，本发明的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有较好批 间重复性(表1)。
[0027] 表1重复性评价结果
实验表明具有很好的重复性，批内重复性和批间重复性的变异系数复合统计学要求。
【主权项】
1. 恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测体系，其特征是：包括一对引 物及一条TaqMan-MGB探针，引物和探针序列如下： 上游引物 Ot-F : 5 ' -TCTRCRCCAGTAATYAITCCTCC-3 ' R=A/G Y=T/C 下游引物 Ot-R :5' -TGTTAAITGCTAGTGCAATGTCTGC-3' 探针 Probe-O :5' -HEX-AAGGACCACACTCTAAT-3' 其中上游引物在第4位、第6位及第15位存在简并性，同时在扩增区域内设计 Taqman-MGB探针，在探针合成时5'端连接HEX荧光基团。2. 恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测体系，其特征是：所述检测体 系中PCR反应体系如下： TaqMan mix buffer 10 I^L Ot-F (10 m) 0.6 m Ot-R (10 m) 0.6 m Probe-0 (10\M) 0. 6 I^L pMD18-T-〇t I m 补足ddH20到20虬 其中pMD18-T-〇t是提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAAT TGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATC TGCTCG 03. 恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法，其特征是： (1) 首先是引物和探针的合成：引物和探针设计步骤如下：1)通过GenBank收集恙虫 病东方体基因序列并进行同源性比对；2)以恙虫病东方体Karp型恙虫病东方体的56-kDa 蛋白基因序列设计引物Ot-F和Ot-R ;3)依据PCR扩增区域内的核酸序列设计特异性的 Taqman-MGB探针序列，并通过GenBank网站比对探针的特异性； (2) 恙虫病东方体阳性对照样品的合成：合成质粒样品，依据GenBank公布的恙虫病东 方体基因序列（GI:63079111)，选取恙虫病东方体引物扩增区域核酸序列（153 bp)，委托宝 生物工程(大连）有限公司进行基因合成，提取质粒作为恙虫病东方体阳性对照样品，命名 为pMD18-T-〇t，合成序列如下： GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGA ATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTG GCGTAGAATCTGCTCG； (3) PCR反应体系的建立：以循环阈值和荧光强度等作为评价指标，以不同的引物浓度 (0. 2 ML~I ML)和探针浓度（0. 2 ML~0. 8 ML)进行配比，优化最佳反应体系如下： TaqMan mix buffer 10 M-L Ot-F (10m) 0.6 ML Ot-R (10m) 0.6 ML Probe-0 (10 M-M) 0. 6 M-L pMD18-T-〇t I ML 补足 ddH20 到 20 ML ; (4)实时荧光定量PCR反应条件优化：通过优化退火温度，优化最佳PCR反应条件如下： 50〇C 2min ;95°C IOmin ;95°C 15s，60°C lmin，循环 45 次，退火时收集荧光信号。4. 根据权利要求3所述的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法， 其特征是：对上述优化的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的反应 体系和反应条件进行评价，包括敏感性评价，特异性评价和重复性评价。5. 根据权利要求4所述的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法， 其特征是：所述敏感性评价方法如下：以制备的PMDlS-T-Ot标准品(浓度梯度为：10^10 1) 为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，以Ig (浓度）为横轴，以循环阈值Ct值为纵轴， 绘制恙虫病东方体实时荧光定量PCR定量关系曲线。6. 根据权利要求4所述的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法， 其特征是：所述特异性评价方法如下：以莫氏立克次体、普氏立克次体、立氏立克次体、Q热 立克次体、噬吞噬细胞无形体及伯氏疏螺旋体病原体DNA为模板，同时以恙虫病东方体阴 性的鼠类基因组DNA及恙虫病东方体阴性的鼠类基因组DNA与pMDIS-T-Ot的混合物作为 阴性对照及阳性对照进行实时荧光定量PCR扩增，对扩增曲线及Ct值进行分析。7. 根据权利要求4所述的恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法， 其特征是：所述重复性评价方法如下： 以同一批次制备的IO6个拷贝的pMD18-T-〇t标准品做为模板进行实时荧光定量PCR扩 增，获得较理想的扩增曲线，通过对5次扩增结果循环阈值（Ct)及Tm值进行统计学分析； 以不同批次制备的IO3和10 7个拷贝的PMDlS-T-Ot标准品做为模板，进行实时荧光定 量PCR扩增，IO3批间重复性试验及10 7批间重复性试验均获得较为理想的扩增曲线，通过 对5次扩增结果循环阈值（Ct值）进行统计学分析。
【专利摘要】本发明公布了一种恙虫病东方体TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法及其检测体系，检测体系由引物、探针、TaqMan mix buffer、ddH2O、pMD18-T-Ot组成。引物及探针包括Ot-F、Ot-R、Probe-O，该引物和探针具有敏感性高，特异性强等特点，该检测方法可检测到5.45个拷贝数的质粒标准品，与莫氏立克次体、立氏立克次体及Q热立克次体等均无交叉反应。本发明可对鼠类、恙螨等样品进行恙虫病东方体检测，适合国境口岸卫生检疫部门开展恙虫病的监测检测工作。
【IPC分类】C12Q1/04, C12R1/01, C12Q1/68
【公开号】CN104975095
【申请号】CN201510408882
【发明人】高玉峰, 宋锋林, 姜陆, 程晓兰, 万雪
【申请人】宋锋林, 高玉峰
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月14日