一种检测鸡免疫相关细胞因子的荧光定量pcr试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽医生物技术领域的检测方法，特别涉及检测鸡免疫相关的6种细胞 因子的荧光定量PCR试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 细胞因子是由机体的网状内皮细胞、淋巴/巨噬细胞以及体细胞在病毒等细胞因 子诱生剂的刺激下产生的，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的低分子量糖蛋白。细胞因 子在生物体的生长分化、免疫调节及疾病应答等方面发挥着重要的作用。例如，当病原入侵 生物体时，机体细胞的模式识别受体在病原相关分子模式的刺激下，启动细胞信号转导通 路，最终导致细胞因子及效应分子表达量的上调，从而促进病原的清除。细胞因子的作用具 有生物种属的特异性。
[0003] 干扰素（Interferon，IFN)和白细胞介素（Interleukin，IL)是两大类重要的细胞 因子，其作用也具有生物种属的特异性。鸡的干扰素系统分为I型干扰素和II型干扰素，鸡 I型干扰素包括IFN-α、IFN-f3，II型包括IFN-γ。鸡白细胞介素（白介素）种类繁多，包 括IL-1，IL-2, IL-6, IL-17, IL-18等。已有的研宄表明，鸡IFN和IL参与了鸡体抵抗多种 病毒（如新城疫病毒、禽流感病毒、传染性支气管炎病毒和传染性法氏囊病毒等）的感染过 程，是鸡体固有免疫和细胞免疫的重要组成部分。
[0004] 检测病毒感染或疫苗免疫对包括鸡细胞因子表达水平的影响，对于深入了解病毒 的致病机制，研宄开发鸡用新型疫苗、免疫增强剂以及抗病毒药物，均具有非常重要的意 义。荧光定量PCR方法具有敏感、快速、实时和所需检测样品少等优点。如果能够开发出商 品化的荧光定量PCR系列试剂盒，用于鸡固有免疫信号通路中相关受体、配体、细胞因子及 效应分子的标准化检测，将为相关的科学研宄和临床应用带来极大的便利。
[0005] 目前国内还没有商品化的检测鸡细胞因子的荧光定量PCR试剂盒。荧光定量PCR 方法检测鸡细胞因子的技术仅被少数研宄型实验室所掌握。由于各实验室所采用的引物、 质粒标准品、反应体系及循环参数各不相同，导致了实验结果间的不可比性，限制了其实际 应用。四川农业大学的汪铭书等公开了"检测北京鸭免疫相关基因转录水平的试剂盒及其 应用"的专利申请，其中包含了检测北京鸭几种细胞因子的检测方法。但是，固有免疫系统 具有严格的动物种属的特异性，检测鸭固有免疫基因的方法无法用于鸡固有免疫相关基因 水平的检测。而且，他们没有公开荧光定量PCR方法的标准曲线，其技术仅能用于鸭相关基 因的相对定量检测，不能用于绝对定量分析。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种鸡IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2和IL-6基因转录 水平的SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒及其应用。本发明提供的检测方法灵敏度高、特 异性强、线性浓度范围广、重复性好、操作简便及省时，可用于多种样品类型中鸡相应细胞 因子的绝对或相对定量检测。
[0007] 为了实现该目的，本发明设计和筛选了 6对特异性引物，从新城疫病毒感染的鸡 胚尿囊液中分别扩增出鸡IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-I β，IL-2和IL-6基因片段。然后， 分别制备了这6个基因的质粒标准品，用于荧光定量PCR反应条件的优选和标准曲线的建 立。通过实际样品的检测应用评估，表明发明所提供的试剂盒可以用作鸡正常生理状态、疫 苗免疫以及疾病状态下，多种样品类型中鸡IFN-a，IFN-β，IFN-γ，IL-I β，IL-2和IL-6 基因的绝对或相对定量检测。
[0008] 本发明具体的技术方案如下。
[0009] 1.提供了检测鸡 IFN-a，IFN-β，IFN-γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 基因的荧光定量 PCR特异性引物。本发明使用Primer Premier 5.0设计特异性PCR引物，经过多对引物的 筛选、得到扩增效率和特异性好的特异性引物。其核苷酸序列分别为：
[0010] 引物对一：
[0011] IFN- a Chicken-υ :5,-GCTCACGCTCCTTCTGAA-3，；
[0012] IFN- a Chicken-L :5'-TGTTGCTGGTGTCCAGG-3'
[0013] 预计扩增片段大小为188bp。
[0014] 引物对二：
[0015] IFN-β Chicken-U :5'-AGGACAAGAAGCAAGCAAG-3' ；
[0016] IFN-β Chicken-L :5'-TGCCTTGGTTTACGAAGCATT-3'
[0017] 预计扩增片段大小为171bp。
[0018] 引物对三：
[0019] IFN-γ Chicken-U :5,-GACAAGTCAAAGCCGCACAT-3，；
[0020] IFN-γ Chicken-L :5'-GTTCATCGGGACCTTGGCCA-3'
[0021] 预计扩增片段大小为120bp。
[0022] 引物对四：
[0023] IL-Iβ Chicken-U :5'-AGGCTCAACATTGCGCTG-3' ；
[0024] IL-Iβ Chicken-L :5'-CCAGGCGGTAGAAGATGA-3'
[0025] 预计扩增片段大小为208bp。
[0026] 引物对五：
[0027] IL-2Chicken-U :5'-CTGTATTTCGGTAGCAAC-3' ；
[0028] IL-2Chicken-L :5'-CACTCCTGGGTCTCAGTTGGT-3'
[0029] 预计扩增片段大小为162bp。
[0030] 引物对六：
[0031] IL-6Chicken-U :5'-TGCAAGAAGTTCACCGTGT-3' ；
[0032] IL-6Chicken-L :5'-CAGGTAGGTCTGAAAGGCG-3'
[0033] 预计扩增片段大小为165bp。
[0034] 2.提供了鸡 IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 质粒标准品。将新城 疫弱毒疫苗株LaSota感染11日龄的SPF鸡胚。在病毒感染24小时后收取鸡胚尿囊液，应 用Trizol法提取其总RNA，然后使用随机引物将RNA反转录为cDNA。分别使用上述6对引 物进行PCR，扩增鸡IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2和IL-6的基因片段。将目的长 度的扩增片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，与PUC57载体连接，转化大肠杆菌。选择疑似阳 性克隆进行测序。测序结果分别与鸡IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-I β，IL-2和IL-6的基 因序列（GenBank Accession No. :EU367971，⑶ 119897, NM_205149, NM_204524, AF000631 和ΗΜ179640)进行比对。测序正确的质粒分别命名为pUC57-IFN-aCh，pUC57-IFN-0Ch， pUC57-IFN-y Ch，pUC57-IL-lβ Ch，pUC57-IL-2Ch 和 pUC57-IL-6Ch。
[0035] 3.本发明提供的检测鸡 IFN-a，IFN-β，IFN-γ，IL-I β，IL-2 和 IL-6 的试剂 盒，分别包括相应的质粒标准品（阳性模板对照），浓度为10 μM的上游引物溶液，浓度为 10μΜ的下游引物溶液，2Χ荧光定量PCR预混液（Master Mix)，和荧光定量PCR缓冲液 (Buffer)。
[0036] 4.本发明可以用于检测多种类型的样品中鸡IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IL-Ιβ， IL-2和IL-6的基因转录水平。样品类型包括但不限于：鸡抗凝全血、鸡脾脏淋巴细胞、鸡 外周血淋巴细胞、鸡血清以及鸡胚尿囊液等。
[0037] 5.本发明提供的检测鸡IFN- a，IFN- β，IFN- γ，IL-I β，IL-2和IL-6的荧光定 量PCR方法，包括以下步骤，
[0038] a.待检样品cDNA的制备：
[0039] 首先根据待检样品的种类（如：鸡抗凝全血、鸡脾脏淋巴细胞、鸡外周血淋巴细 胞、鸡血清以及鸡胚尿囊液），提取样品RNA。然后，使用随机引物进行反转录反应，制备样 品的cDNA。
[0040] b.配制PCR反应体系：
[0041] PCR扩增反应的体系均为20 μ 1，包括：2X荧光定量PCR预混液10 μ 1，10 μΜ上游 引物1 μ 1，10 μ M下游引物1 μ 1，荧光定量PCR缓冲液2 μ 1，DNA模板2