专利名称：一种高效表达目的蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效表达目的蛋白的方法。
背景技术：
抗体分子片段与其它蛋白融合，可得到具有多种生物学功能的融合蛋白，将酶、毒素、细胞因子等生物活性物质的基因与抗体融合，可将这些生物活性靶向到特定的靶部位，能有效地发挥生物学功能，降低毒副作用。将抗体片段与细胞因子融合是靶向治疗肿瘤的有效手段，此类融合蛋白被称为“免疫细胞因子”。目前，免疫细胞因子的产量成为目前制约其临床大规模应用的最大障碍。大多数文献报道中免疫细胞因子的产量均低于20μg/ml，难以达到规模化生产的要求。迄今为止只有一种免疫细胞因子在临床试验中应用。
已上市的以及正处于临床试用中的基因工程抗体多达上百种，其中绝大多数都是在哺乳动物细胞中表达的，更确切地说，是在CHO细胞中表达的。因此，对CHO细胞的改造以及培养条件的优化成为人们研究的热点。如Pak等将胰岛素样生长因子和转铁蛋白基因转入CHO细胞，使之成为能自分泌这两种蛋白的超级CHO细胞(Pak SCO，Hunt SMN，Bridres MW et al.SuperCHO-a cell line capable of autocrine growth under fully defined protein freeconditions.Cytotechnology.1996，22139-146.)；利用基因工程的方法，将Bcl-2基因(细胞凋亡抑制基因)导入工程化的CHO细胞，可减少细胞凋亡，提高目的蛋白的产量(Figueroa B Jr，Sauerwald TM，Mastrangelo AJ，Hardwick JM，Betenbaugh MJ.omparison of Bcl-2to a Bcl-2 deletion mutant for mammaliancells exposed to culture insults.Biotechnol Bioeng.2001，73(3)211-22)；向CHO细胞中导入P21或P27基因，可使细胞阻滞于G1期，从而提高外源蛋白产量(Carvalhal AV，Marcelino I，Carrondo MJ.Metabolic changes during cellgrowth inhibition by p27 overexpression.Appl Microbiol Biotechnol.2003，63(2)164-73；Ibarra N，Watanabe S，Bi JX，Shuttleworth J，Al-Rubeai M.Modulation of cell cycle for enhancement of antibody productivity in perfusionculture of NSO cells.Biotechnol Prog.2003，19(1)224-8)。提高培养基的渗透压，或在培养环境中加入丁酸钠或AMP也可达到类似效果。
培养温度是影响重组蛋白类药物生产的重要因素之一。优化培养温度，可提高重组蛋白的产量。与其他方法相比，此方法操作简便，有较好的实用价值。但一些研究表明，仅通过优化培养温度，并不能使重组蛋白的产量提高到理想水平。(Yoon SK，Song JY，Lee GM.Effect of low culture temperatureon specific productivity，transcription level，and heterogeneity of erythropoietin inChinese hamster ovary cells.Biotechnol Bioeng.2003，82(3)289-98)这是因为降低培养温度可提高目的蛋白的比生成率，但同时导致细胞增殖抑制，降低了细胞的相对数量，从而影响了目的蛋白产量的提高。因此，如何利用优化培养温度来提高重组蛋白产量仍需进一步研究。
发明内容
为了提高重组融合蛋白的产量，本发明公开了一种高效表达目的蛋白的方法，该方法包含两个主要内容1.优化稳定表达目的蛋白的工程化细胞株的培养温度；2.进行两阶段培养。
本发明的方法如下第一阶段在36.5℃-37.8℃的培养温度下使稳定表达目的蛋白的工程化CHO细胞株生长至合适密度，第二阶段将培养温度降至25℃-32℃，继续培养至合适时间，收集上清并纯化蛋白。
其中培养温度的优化通过以下方法进行培养温度对重组蛋白表达量的影响将经筛选得到的稳定表达重组蛋白的细胞株，分别在25℃-32℃和36.5℃-37.8℃下进行培养，25℃-32℃下重组蛋白的比生成率显著高于36.5℃-37.8℃，同时细胞增殖明显受到抑制。重组蛋白的产量没有得到有效提高。
两阶段培养方法的应用在36.5℃-37.8℃下使细胞增殖至90％铺满，将培养温度降低至25℃-32℃继续培养。于合适时间收集上清，经检测重组蛋白的产量得到显著提高。
本发明是基于优化培养温度和两阶段培养方法，提高重组蛋白产量。即当细胞增殖到理想密度后，再降低培养温度，使目的蛋白的产量得到有效提高。目前在免疫细胞因子类重组蛋白的表达中，未见有此种策略的应用报道。将本发明应用于免疫细胞因子类重组蛋白的真核表达可有效提高目的蛋白产量。其优点在于方法简便、易行，提高产量，但不提高成本。大大节省了时间、人力、物力和财力。无论对于实验室规模或商业化生产均有较好的应用价值。
图1为不同温度下融合蛋白表达量随时间变化示意2为不同温度下细胞增殖情况示意3为不同温度下细胞活力变化示意4为不同温度下细胞凋亡情况示意5为FACS分析融合蛋白与Her2表面阳性细胞的结合活性，其中左图为阴性对照，右图为融合蛋白图6为MTT法检测在不同温度下生产的融合蛋白的生物学活性具体实施方式
利用两阶段培养方法提高融合蛋白(HFI)在重组CHO细胞中的表达量1.材料稳定表达融合蛋白HFI的CHO细胞株(Shi，M.，Xie，Z.，Feng，J.，Sun，Y.，Yu，M.，Shen，B.，Guo，N.，2003.A recombinant anti-ErbB2，scFv-Fc-IL-2 fusion protein retains antigenspecificity and cytokine function.Biotechnol.Lett.25，815-819)；DMEM培养基和无蛋白培养基HyQSFM4CHO由HyClone公司生产；羊抗人IgG、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG购自北京中山生物技术公司。
2.方法和结果将稳定表达融合蛋白anti-erbB2-ScFv-Fc-IL-2的重组CHO细胞株以2×106/瓶的数量，接种于底面积为25cm2的培养瓶中，共16瓶。应用的培养基为DMEM+10％FBS，在36.5℃-37.8℃下培养待细胞贴壁后，用无血清培养基洗三次，加入5ml的无蛋白培养基HyQSFM4CHO。其中8瓶放入36.5℃-37.8℃继续培养，另外8瓶放于25℃-32℃培养。每间隔24小时取出一瓶细胞，检测以下各种指标的变化。
1.不同温度下融合蛋白HFI表达量变化情况采用夹心ELISA法检测融合蛋白的瞬时表达。用羊抗人IgG(10μg/ml，pH9.6)包被ELISA板4℃过夜，充分洗涤后用含1％BSA的PBS 37℃封闭1h，洗涤后加入待测上清37℃孵育1h，洗涤后加入HRP-GAH IgG 37℃孵育l h，洗涤后以OPD显色，洗液为含0.05％Tween20的PBS。结果显示应用两阶段培养策略可使融合蛋白的产量提高2倍以上，见图1。
2.不同温度下细胞增殖情况计数细胞总数观察细胞增殖情况，结果见图2；3.不同温度下细胞活力检测用苔盼蓝染色的法检测细胞活力，吸出培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1-2分钟，然后加入5ml培养液制成细胞悬液。取0.5ml苔盼蓝溶液(4％的苔盼蓝溶液，用PBS配置)、0.5ml培养液，充分混匀，然后放置15分钟，取10ul混合液，注入细胞计数板小室。计数500个细胞，并计数其中着色细胞。细胞活力(％)＝(细胞总数-着色细胞)÷总细胞数×100％。结果显示细胞在30℃的培养条件下可在长时间内保持较高的活力，见图3。
4.用PI染色法及FACS法检测细胞凋亡情况的变化细胞用消化液消化后，用预冷PBS洗2次后，移入1.5ml Ep管中，离心去上清。每管加入1ml 70％乙醇，4℃下固定18小时以上。离心去乙醇，再用PBS洗2次，加入100ul RNAaseA(0.1mg/ml)，于37℃消化30分钟。加入0.1mg/ml碘化丙啶(PI)染液100ul，4℃避光染色30分钟。2小时内测FACS，以ModFit LT软件分析。结果显示30℃下细胞凋亡的比例明显少于37℃下培养的细胞，见图4。
5.用FACS法和MTT法分析融合蛋白生物活性的变化
0.02％EDTA消化SK-BR-3细胞，用冷PBA(PBS，2％BSA，0.1％NaN3)离心洗涤2次；与融合蛋白(100ng/ml)0℃振荡孵育30min，以冷PBA离心洗涤2次，与FITC-GAH IgG 0℃振荡孵育30min；冷PBA离心洗涤2次，PBS重悬细胞，用FACSCalibur仪器进行分析，结果显示30℃下生产的融合蛋白可与SK-BR-3细胞结合，见图5。
将IL-2依赖的CTLL-2细胞，用含15％小牛血清的1640培养基洗3次，以3×104/孔的数量传入96孔板，同时将经过定量后的表达上清以不同浓度梯度加入96孔板，37℃培养20小时。加入MTT(5ng/ml，用PBS配置)10ul。4小时后加入DMSO裂解细胞，OD570比色，结果显示在低温下生产的融合蛋白的生物学活性与37℃下无显著差别，见图6。
权利要求
1.一种高效表达免疫细胞因子类重组蛋白的方法，其特征在于优化工程化CHO细胞株培养温度和两阶段培养策略。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于两阶段培养的第一阶段，是在常规培养温度36.5℃-37.8℃下，使稳定表达目的蛋白的工程化CHO细胞株生长至适当密度；第二阶段是将温度降低至25℃-32℃。
3.根据权利要求1所述方法，其中免疫细胞因子类重组蛋白为融合蛋白anti-erbB2-ScFv-Fc-IL-2。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达目的蛋白的方法。该方法通过优化稳定表达目的蛋白的工程化CHO细胞株的培养温度，并利用两阶段培养策略，使融合蛋白表达量得到显著提高。本发明的方法简单、易行、高效，不提高成本。无论对于实验室规模或商业化生产均有较好的应用价值。
文档编号C07K19/00GK1869214SQ20051001177
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月24日 优先权日2005年5月24日
发明者施明, 郭宁, 沈倍奋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所