一种定量检测蛋白质相互作用强度的方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测蛋白质相互作用强度的方法，引入相对报告因子表达量，结合流式细胞检测技术与细菌双杂交系统，实现了蛋白质相互作用强度的定量检测。
【专利说明】
一种定量检测蛋白质相互作用强度的方法
技术领域
[0001] 本发明属于蛋白质检测技术领域，具体涉及一种定量检测蛋白质相互作用强度的 方法。
【背景技术】
[0002] 定性筛选与鉴定和定量分析是蛋白质相互作用研究的两个主要目的，蛋白质相互 作用的体内定量检测有助于增进我们对蛋白质相互作用网络和相互作用结构基础的理解。 对其他相关领域的研究，比如设计新的相互作用蛋白对，抗体亲和力成熟研究等也有促进 作用。但目前很少有方法可以在高通量筛选的同时做到定量分析。以等温滴定为代表的定 量分析方法多用于已知相互作用蛋白的分析，一般需要对蛋白质进行纯化，导致实验过程 相对复杂，无法满足高通量检测的要求，而且体外检测无法反映蛋白质在细胞内的真实情 况。以酵母双杂交技术为代表的体内检测技术虽然具备高通量、操作简单等优点，但是由于 这类方法并不直接检测相互作用蛋白，而是通过转录激活等原理间接获得相互作用信息。 以酵母双杂交技术为例，常用的检测转录激活的报告因子包括半乳糖苷酶、荧光素酶、荧 光蛋白以及生长曲线。然而，由于转录激活的机制复杂，目前还无法通过对报告因子的检测 对蛋白_蛋白相互作用进行定量分析。此外，在细胞中还有其他因素会影响蛋白相互作用以 及报告因子的读出，比如蛋白质、mRNA的稳定性和翻译活性以及质粒拷贝数等。因为无法建 立相互作用强度与报告因子读出之间的数量关系，所以这类方法只能用于定性研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种定量检测蛋白质相互作 用强度的方法，引入相对报告因子表达量，结合流式细胞检测技术与细菌双杂交系统，实现 了蛋白质相互作用强度的定量检测。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005] -种定量检测蛋白质相互作用强度的方法，基于细菌双杂交系统与流式细胞检测 技术，包括：
[0006] 1)选择一对待确定相互作用强度的蛋白质A与蛋白质B;构建带有编码蛋白质A的 基因序列a与第一标签的第一载体，构建带有编码蛋白质B的基因序列b与第二标签的第二 载体;其中第一载体为低拷贝载体，第二载体为高拷贝载体；
[0007] 2)将所述第一载体与第二载体共转化至报告细菌，得到同时包含基因序列a和基 因序列b的重组细胞；
[0008] 3)在适合表达蛋白质A与蛋白质B的条件下，培养步骤2)得到的重组细胞；重组细 胞表达蛋白质A与蛋白质B;蛋白质A与蛋白质B相互作用后可促进报告基因的转录与表达， 产生报告因子；
[0009] 4)在步骤3)得到的体系中对报告因子和第一标签进行直接或间接的免疫荧光双 染;通过流式细胞检测技术分别检测报告因子和第一标签相对应的荧光强度，分别得到报 告因子和蛋白质A的表达量;例如，在步骤3)得到的体系中加入报告因子对应的荧光底物， 报告因子可水解该荧光底物，产生荧光物质;通过流式细胞仪检测该荧光物质的荧光强度 可得到报告因子的表达量;第一标签的免疫荧光染色和流式检测采用本领域常规技术即可 完成;报告因子表达量与蛋白质A表达量的比值为相对报告因子表达量，该相对报告因子表 达量的值可定量蛋白质A与蛋白质B相互作用的强度:该相对报告因子表达量的值越大，表 明蛋白质A与蛋白质B的相互作用越强;该相对报告因子表达量的值越小，表明蛋白质A与蛋 白质B的相互作用越弱。
[0010]免疫荧光染色的过程中，对于非跨膜荧光底物，加入荧光底物染色前需对重组细 胞进行破膜处理，改变细胞的渗透性;对于可跨膜荧光底物，可直接进行荧光染色;所述荧 光底物的终浓度可为10nM~ImM，反应时间可为1~240min，反应温度可为4~80°C。
[0011] -实施例中：所述第一标签为His，Flag，TC，HA。
[0012] -实施例中：所述第二标签为Flag，His，TC，HA。
[0013] 一实施例中：所述第一载体为 pKT25，pKT25N，pKT25-Hi s。
[0014] 一实施例中：所述第二载体为 pUT18C，pUT18，pUT18-Flag。
[0015] -实施例中：：所述报告细菌为E.coli BTH101，E.coli DHM1。
[0016] -实施例中：所述报告基因为lacZ，gfp，egfp;其对应的报告因子分别为半乳糖 苷酶，GFP，EGFP。
[0017] 本发明采用的仪器、设备、材料、试剂等，除有特别说明外，均可从市面上购买到。 本发明中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验 室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0018] 本技术方案与【背景技术】相比，它具有如下优点：
[0019] 本发明引入相对报告因子表达量，结合流式细胞检测技术与细菌双杂交系统，实 现了蛋白质相互作用强度的定量检测，克服了现有技术中由细菌异质性、培养时间、诱导浓 度等各种因素导致的无法通过检测报告因子或相互作用蛋白来定量蛋白相互作用强度的 缺陷，实现了在单细菌水平对体内蛋白质相互作用强度的灵敏、快速、高分辨定量检测。
【附图说明】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0021] 图1为实施例2中e-gal酶活性检测结果。
[0022] 图2为实施例2中TolB蛋白和Pal蛋白的Western blot检测结果。
[0023]图3为实施例2中在不同培养时间下重组细胞表达P-gal和TolB蛋白的双参数检测 流式直方图。
[0024] 图4为实施例2中MFIe-gai值和MFlHis-t〇ib值的线性曲线。
[0025]图5为实施例4中双参数流式检测所得的不同单菌落中P-gal表达与His-TolB表达 的相关曲线。
[0026]图6为实施例4中P-gal酶活与相对报告因子表达量RRPE的相关性。
[0027]图 7 为实施例 5 中质粒 pKT25-His-tolBA22-25 和 pKT25-His-tolBA22-33 的构建过程的 琼脂糖凝胶电泳结果。
[0028]图8为实施例5中三种不同相互作用强度蛋白对双杂交细菌某一单菌落样品的双 荧光散点图以及它们对应荧光通道的信号分布直方图。
[0029] 图9为实施例5中Pal与TolB、TolBA22-25和TolB A22-33各自构成的双杂交细菌的相对 报告因子表达量。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过实施例具体说明本发明的内容：
[0031] 实施例1:利用本发明的定量检测方法检测蛋白对的相互作用强度
[0032] 1)选择一对待确定相互作用强度的蛋白质A与蛋白质B，本实施例之中以TolB蛋白 和Pal蛋白为例，它们是革兰氏阴性细菌内膜蛋白质系统中Tol-Pal系统的两个功能蛋白， TolB蛋白和Pal蛋白相互作用组成了细菌外膜复合体。
[0033]以大肠杆菌K12基因组为模板，设计tolB和pal基因的引物并于生工合成，通过PCR 分别获取tolB和pal基因，将它们分别插入细菌双杂交载体pKT25(带有His标签，且为低拷 贝质粒）、pUT18C(带有Flag标签，且为高拷贝质粒）的EcoR I和Xho I酶切位点，构建得到 pKT25-His-tolB与pUT18C-Flag-pal。
[0034] 2)将上述pKT25-His-tolB与pUT18C-Flag-pal共转化至报告细菌E.coli BTH101 感受态中，培养得到同时包含tolB基因序列和pal基因序列的重组细胞E. col i BTH101pKT25-His-tolB/pUT18C-Flag-pal，完成细菌双杂交系统的构建。采用常规的蓝白 斑筛选及比色定量法确定上述细菌双杂交系统的成功建立，同时采用Western Blot、免疫 共沉淀、荧光显微镜等传统生物学实验手段进行验证。
[0035] 3)用接种环刮取少量上述重组细胞E.coli BTH101pKT25-His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上划线，并于30°C培养48h;用灭菌牙签随机挑取一个单菌落，接种 于含有l〇〇yg/mL氨苄青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培养基中，IPTG诱导下，30°C，250rpm 摇床培养，诱导重组细胞表达To 1B蛋白和Pal蛋白，To 1B蛋白和Pal蛋白相互作用后促进报 告基因lacZ的转录与表达，产生报告因子半乳糖苷酶⑴-gal)。
[0036] 4)检测上述体系中相对报告因子表达量（Relative reporter protein expression，RRPE)的值，可得到TolB蛋白和Pal蛋白的相对相互作用强度:该相对报告因子 表达量的值越大，表明TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用越强;该相对报告因子表达量的值越 小，表明To 1B蛋白和Pa 1蛋白的相互作用越弱。具体地：
[0037] 将相对报告因子表达量（Relative reporter protein expression，RRPE)定义 为：
[0038] 相对报告因子表达量RRPE =报告因子f3_ga 1表达量/To 1B蛋白表达量
[0039] 本实施例之中，采用免疫荧光双染的方法进行，在步骤3)得到的体系中加入对应 报告因子P-gal的荧光底物C12FDG; P-gal可水解C12FDG，产生绿色荧光;通过流式细胞仪检 测绿色焚光强度(用绿色焚光的焚光中位值(Median fluorescence intensity，MFI)表征， 记为MFIe-gal)可得到报告因子P-gal的表达量；同时，通过流式细胞仪检测His标签(采用本 领域常规技术进行荧光染色）的红色荧光强度（用红色荧光中位值表征，记为MFI Hls-TcilB)可 得到TolB蛋白的表达量；因而，通过流式细胞仪检测两种荧光强度即可得到相对报告因子 表达量RRPE的值，即为：
[0040] 相对报告因子表达量 RRPE=MFIe-gai/MFlHis-T〇iB
[0041]这样，通过流式细胞仪检测即可得到相对报告因子表达量的值，从而直观地判断 TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用强度。
[0042]利用上述方法，可以定量检测任意一对蛋白质的相互作用强度。
[0043]实施例2:本发明的定量检测方法的验证之一:不同培养时间下的有效性验证 [0044] 1)用接种环刮取少量实施例1中步骤2)得到的重组细胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上划线，并于30°C培养48h。用灭菌牙签随机挑取 一个单菌落，接种于装有15mL含100yg/mL氨苄青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培养基的锥 形瓶中，30°C，250rpm摇床培养。从第12h开始，每隔2h从锥形瓶中取出适量菌液直至20h，将 剩余的菌液放回摇床中继续培养。取出的菌液先调节OD600至1.0，接着取其中的200yL进行 固定处理，其余菌液置于4°C保存。固定后的细菌重悬于GTE缓冲液中，并被保存于4°C，待检 测用。
[0045] 2)参照实施例1中步骤4)的方法，通过流式细胞仪检测本实施例步骤1)中不同培 养时间的菌液中MFIe- gai值和MFIHis-toib值，计算得到检测相对报告因子表达量RRPE。理论 上，TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用强度是一定的，因而可以反过来验证用相对报告因子表 达量RRPE来对蛋白相互作用强度进行定量是否有效。
[0046] 同时，作为对比地，检测报告因子P-gal的表达量、酶活，TolB蛋白和Pal蛋白的表 达量，验证其是否可用于对蛋白-蛋白相互作用进行定量分析。
[0047]对比实验的结果如图1至图3所示。图1中可看出，细菌总体的P-gal酶活性从第12h 的375. lU/mL上升到第16h的702. lU/mL，之后开始逐渐下降。同样的，TolB蛋白和Pal蛋白的 Western blot实验也出现了类似现象（图2)。另一方面，通过流式细胞仪在单细菌水平的分 析可知，随着培养时间的增加，表达蛋白的细菌比例以及单个细菌的蛋白表达量均有明显 变化。图3是不同培养时间下重组细胞蛋白表达双参数检测的流式直方图，其中FL1为绿色 荧光通道，代表P-gal的表达情况;FL2为红色荧光通道，代表His-TolB蛋白的表达情况。可 见，表达P-gal蛋白和His-TolB蛋白的阳性菌比例随培养时间的延长不断升高（从7.5%到 75.5%)，而这部分阳性菌细菌的荧光强度却一直下降，其荧光中位值分别从14500(FL1)和 4155(FL2)下降到2508和495,说明单个细菌的蛋白含量随培养时间的增加反而降低，这一 现象可能是由细菌分裂导致的蛋白质稀释引起;而阳性菌比例的增加和单个细菌蛋白表达 量的下降，也在单细菌水平解释了图1和图2中0-gal、TolB蛋白和Pal蛋白的总体表达量/活 性含量先升高后下降的现象。
[0048] 正是由于上述原因，导致报告因子0-gal的表达量、酶活，或者TolB蛋白和Pal蛋白 的表达量都无法用于对蛋白相互作用强度进行定量分析。
[0049] 然而，利用本发明的方法，如图4所示，通过流式细胞仪检测本实施例步骤1)中不 同培养时间的菌液中MFIe-gai值和MFI His-toib值，计算得到检测相对报告因子表达量RRPE。图 4中可以看出，MFIe- gai值和MFIHis-toib值具有非常好的线性关系(R2 = 0.9995)，表明随着培养 时间的延长，MFIe-gai值和MFIHi s-toib值的比值RRPE仍然保持恒定，不受培养时间的影响。这 也反过来验证了本发明的采用相对报告因子表达量RRPE来对蛋白相互作用强度进行定量 的方法，可以排除培养时间的影响，是有效的。
[0050] 实施例3:本发明的定量检测方法的验证之二:不同的诱导剂IPTG浓度下的有效性 验证
[0051 ] 1)用接种环刮取少量实施例1中步骤2)得到的重组细胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上划线，并于30°C培养48h。用灭菌牙签随机挑取 一个单菌落在50yL的LB培养基中搅拌并尽量混勾。从中分别取10yL菌液加入到15mL各含0、 50、500yM IPTG，以及100yg/mL氨苄青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培养基中，30°C，250rpm 摇床培养。分别在第6、10、14、18h时取出适量菌液，调节0D 6QQ至1.0，于4 °C保存，待检测。 [0052] 2)参照实施例1中步骤4)的方法，通过流式细胞仪检测本实施例步骤1)中在不同 IPTG浓度诱导下培养的菌液中MFIe-gai值和MFIHis-toib值，计算得到检测相对报告因子表达 量RRPE。理论上，TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用强度不受IPTG浓度的影响，是一定的，因而 可以反过来验证用相对报告因子表达量RRPE来对蛋白相互作用强度进行定量是否有效。 [0053] 结果显示，在不同的IPTG浓度诱导情况下，MFIe- gai值和MFIHis-toib值的比值RRPE仍 然保持恒定，不受IPTG浓度的影响。这也反过来验证了本发明的采用相对报告因子表达量 RRPE来对蛋白相互作用强度进行定量的方法，可以排除IPTG浓度的影响，是有效的。
[0054]实施例4:本发明的定量检测方法的验证之三:不同单菌落得到的体系中的有效性 验证
[0055]本领域技术人员可知，细菌个体之间的异质性有时会造成蛋白表达量的巨大差 异，而这些差异可能随着细菌的增殖而不断传递和放大，最终导致菌落之间的异质性。由不 同单菌落扩增得到的体系中，其P-gal酶活往往有巨大差异，因而对于不同单菌落扩增得到 的体系，通过测定0-gal酶活来判断TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用强度是不准确的。本实 施例之中，验证了相对报告因子表达量RRPE是否适用于不同单菌落培养得到的体系中蛋白 相互作用强度的检测。
[0056] 1)用接种环刮取少量实施例1中步骤2)得到的重组细胞E.coli BTH101pKT25- His-tolB/pUT18C-Flag-pal在抗性LB平板上划线，并于30°C培养48h。用灭菌牙签随机挑取 若干个单菌落，分别接种于2mL含100yg/mL氨苄青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB培养基中， 30°C，250rpm摇床培养16h。将菌液的0D600值调节至1.0待用。
[0057] 2)参照实施例1中步骤4)的方法，通过流式细胞仪检测本实施例步骤1)中由不同 单菌落培养得到的体系中MFIe-gai值和MFIHis-toib值，计算得到检测相对报告因子表达量 RRPE。理论上，即使在不同单菌落中，TolB蛋白和Pal蛋白的相互作用强度也都是一定的，因 而可以反过来验证用相对报告因子表达量RRPE来对蛋白相互作用强度进行定量是否有效。 [0058]结果：图5显示了双参数流式检测所得的不同单菌落中P-gal表达与His-TolB表达 的相关曲线，可见MFIe- gai值和MFIHis-toib值之间依然存在良好的线性关系(R2 = 0.9789)，即 相对报告因子表达量RRPE仍然保持恒定，与理论上"TolB蛋白和Pal蛋白在不同单菌落中的 相互作用强度一定"相符合，表明RRPE不受不同单菌落的影响。因而也反过来验证了本发明 的采用相对报告因子表达量RRPE来对蛋白相互作用强度进行定量的方法，可以排除不同单 菌落这个因素的影响，是有效的。
[0059]图6显示了P-gal酶活与相对报告因子表达量RRPE的相关性。P-gal酶活和RRPE的 平均值分别为255.11 ±112.03和2.04±0.16,各自的变异系数为44%和8%。结合图5中的 线性拟合曲线判断，表明二者具有良好的相关性。
[0060]此外，除了实施例2-4中提到的培养时间、诱导剂浓度和不同单菌落对报告因子表 达和活性的影响之外，还有一些因素导致无法单独用报告因子的量来定量蛋白间的相互作 用强度。通过实验虽然可以排除细菌双杂交系统中质粒丢失的情况。然而基于单细菌水平 的研究发现细菌双杂交系统中细菌个体存在明显的异质性。
[0061]大肠杆菌中存在全或无的现象，即在乳糖操纵子的作用下，随着培养基中乳糖类 似物(TMG)浓度的增加，不是所有大肠杆菌个体都线性地增加半乳糖苷酶表达，而是有些 个体完全高活性地表达lacZ基因，而另一部分个体则完全不表达。细菌双杂交系统中，报告 基因和相互作用蛋白的表达受乳糖操纵子调控，因而蛋白的表达同样存在双稳态现象。并 且，相互作用蛋白的表达、cAMP的生成、报告基因的表达形成更为复杂的三级正反馈调节系 统。此外，两种质粒在转化以及细菌分裂时分配的随机性，会导致细菌个体间质粒拷贝数的 不同，造成蛋白表达量的差异，最终影响到菌落中蛋白表达的比例。
[0062]因而，单纯通过检测报告因子或相互作用蛋白的量，无法实现对蛋白相互作用强 度的准确定量。但通过本发明的方法，引入相对报告因子表达量，结合流式细胞检测技术与 细菌双杂交系统，能够排除各项细菌异质性、培养时间、诱导浓度等因素的影响，实现蛋白 质相互作用强度的定量检测。
[0063]实施例5:本发明的定量检测方法的验证之四：对具有不同相互作用强度的蛋白对 的有效性验证
[0064]本实施例之中，验证了本发明的定量检测方法是否适用于不同相互作用强度的蛋 白对的检测。
[0065] TolB-Pal蛋白对中，TolB由N端的a/f3型结构域以及C端与Pal相互作用的f3-propeller型结构域两部分组成。TolB是一个周质蛋白，含有一段21个氨基酸的信号肽，并 能够在蛋白进入周质空间时裂解。有文献指出，To 1B蛋白N端不同长度的敲除会对与Pal的 相互作用产生影响，使二者的亲和力下降（Bonsor D A，Hecht 0，Vankemmelbeke M，et al.Allosteric beta-propeller signalling in TolB and its manipulation by translocating colicins[J] .Embo Journal，2009，28(18): 2846-2857 ?)。因此，本实施例 之中，对TolB蛋白N端进行不同长度的敲除(分别为22-25和22-33号氨基酸残基缺失），利用 其与Pal亲和力的变化，得到具有不同相互作用强度的蛋白对，采用本发明的方法检测，可 以反过来验证本发明的定量检测方法是否适用于各种蛋白对。
[0066] 1)质粒 pKT25-His-tolBA22-25 和 pKT25-His-tolBA22-33 的构建：
[0067] 以质粒pEB362为模板，利用SEQ ID No.5至SEQ ID No.7所示的引物tolBA22-25-F、 tolBA22_ 33-F和tolB-R，通过PCR反应分别获得两端带有限制性酶切位点EcoR I和Xho I的 tolBA22-25和tolBA22-33的基因，设置PCR反应体系如下：
[0069]以上体系混匀后平均分成两管，按如下程序进行PCR反应：
[0071] PCR反应结束后，首先对产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，之后利用DNA片段纯化试 剂盒对PCR产物进行纯化回收。
[0072] 对质粒pKT25-His_tolB和以上PCR产物分别按如下反应体系进行双酶切：
[0074] 以上体系混匀后分成4管，于37 °C反应3h。质粒的酶切产物采用切胶回收;PCR产物 酶切后用DNA片段纯化试剂盒回收。所有纯化回收后的产物均用琼脂糖凝胶电泳验证，并用 NAN0-DR0P 测定 DNA 浓度。
[0075] 利用T4连接酶将以上双酶切后的质粒载体与PCR产物连接，设置体系如下：
[0077]连接体系于16°C反应过夜，之后转化至E.coli ER2738感受态细菌中。在含有卡那 霉素的平板上挑取单菌落进行PCR验证，将阳性克隆扩大培养后送测序公司测序。
[0078]如图7所示，A为目的片段PCR后琼脂糖凝胶电泳的结果，tolBA22_25和tolB A22_33基 因的理论长度分别为1218bp和1194bp，对照DNA marker可知两者的条带位置正确。B为质粒 载体pKT25-His-tolB和PCR产物双酶切纯化后的电泳结果，其中质粒载体的理论长度约为 3400bp，三者的条带位置均接近理论值。C为菌落PCR验证的电泳结果，几个单菌落均有PCR 产物，且条带位置正确，说明质粒载体中成功插入了目的基因片段。进一步的测序结果证明 插入基因片段的序列完全正确。表明pKT25-His-tolB A22-25和pKT25-His-tolBA22-33质粒成 功构建。
[0079] 2)参照实施例1中的步骤，将构建成功的质粒pKT25-His-tolBA22- 25和pKT25-His- tolBA22-33 ,以及pKT25-His-tolB，分别和质粒pUT18C-Flag-pal共转化至报告菌株E.coli BTH101中，接着各自挑取3个单菌落培养;之后进行免疫荧光双染，并用流式细胞仪检测。 [0080]图8显示了三种不同相互作用强度蛋白对双杂交细菌某一单菌落样品的双荧光散 点图以及它们对应荧光通道的信号分布直方图。三者的蛋白表达比例各异。但是通过计算 各自的相对报告因子表达量可以看出该参数与蛋白的相互作用强度有很好的相关性。如图 9所示，Pal与T 〇lB、T〇lBA22-25和T〇lB A22-33各自构成的双杂交细菌的相对报告因子表达量分 别为2.04±0.21、0.88 ±0.07和0.91 ±0.06,而文献报道的三者的解离常数分别为38 土 3碰、313$151^1和337±18碰，而解离常数越小，相互作用越强。有上述结果可知，当蛋白 对的相互作用越强，相对报告因子表达量则越大。以上实验结果，一方面验证了本发明的定 量方法在不同相互作用强度蛋白对中的有效性，也进一步说明了相对报告因子表达量能用 于细菌双杂交系统中各种蛋白对相互作用强度的评估。
[0081 ]附：
[0082]本发明实施例中，涉及的引物如下所示（同时记载在说明书核苷酸和氨基酸序列 表)：
[0084]本发明实施例中，除有特别说明外，其余的PCR反应体系如下所示：
[0086]本发明实施例中，除有特别说明外，其余的PCR反应进程如下所示：
[0088] 将质粒、细菌基因组或者菌液（重悬于超纯水中，95°C加热处理lOmin)样品与PCR 反应的其他组份按4倍用量混合均匀后，分装至荧光定量PCR专用的PCR管中，每管20yL，共3 管，作为平行样进行PCR反应。
[0089]以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依 本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【主权项】
1. 一种定量检测蛋白质相互作用强度的方法，其特征在于:基于细菌双杂交系统与流 式细胞检测技术，包括： 1) 选择一对待确定相互作用强度的蛋白质A与蛋白质B;构建带有编码蛋白质A的基因 序列a与第一标签的第一载体，构建带有编码蛋白质B的基因序列b与第二标签的第二载体； 其中第一载体为低拷贝载体，第二载体为高拷贝载体； 2) 将所述第一载体与第二载体共转化至报告细菌，得到同时包含基因序列a和基因序 列b的重组细胞； 3) 在适合表达蛋白质A与蛋白质B的条件下，培养步骤2)得到的重组细胞；重组细胞表 达蛋白质A与蛋白质B;蛋白质A与蛋白质B相互作用后可促进报告基因的转录与表达，产生 报告因子； 4) 在步骤3)得到的体系中对报告因子和第一标签进行直接或间接的免疫荧光双染;通 过流式细胞检测技术分别检测报告因子和第一标签相对应的荧光强度，分别得到报告因子 和蛋白质A的表达量;报告因子表达量与蛋白质A表达量的比值为相对报告因子表达量，该 相对报告因子表达量的值可定量蛋白质A与蛋白质B相互作用的强度:该相对报告因子表达 量的值越大，表明蛋白质A与蛋白质B的相互作用越强;该相对报告因子表达量的值越小，表 明蛋白质A与蛋白质B的相互作用越弱。2. 根据权利要求1所述的定量检测蛋白质相互作用强度的方法，其特征在于:所述第一 标签为 His，Flag，TC，HA。3. 根据权利要求1所述的定量检测蛋白质相互作用强度的方法，其特征在于:所述第二 标签为 Flag，His，TC，HA。4. 根据权利要求1所述的定量检测蛋白质相互作用强度的方法，其特征在于:所述第一 载体为 pKT25，pKT25N，pKT25-Hi s。5. 根据权利要求1所述的定量检测蛋白质相互作用强度的方法，其特征在于:所述第二 载体为 pUT18C，pUT18，pUT18-Flag。6. 根据权利要求1所述的定量检测蛋白质相互作用强度的方法，其特征在于:所述报告 细菌为E. coli BTHlOl，E. coli DHMl。7. 根据权利要求1所述的定量检测蛋白质相互作用强度的方法，其特征在于:所述报告 基因为IacZ，gf ρ，egf ρ;其对应的报告因子分别为β-半乳糖苷酶，GFP，EGFP。
【文档编号】G01N33/533GK105891462SQ201610474048
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】吴丽娜, 汪旭, 颜晓梅
【申请人】厦门大学