专利名称：一种应用代谢组学技术定量评价药效的方法
技术领域：
本发明涉及药效定量评价的新方法，具体涉及采用气相色谱方法定量检测人、动 物或细胞中内源性小分子化合物、采用多变量数据处理方法计算数学模型、计算给药组与 对照组相对距离作为药效定量评价的方法。
背景技术：
长期以来，在药理研究中，许多药物的药效依靠定性而非定量、主观而非客观、粗 略而非准确、片面而非全面的标准进行评价，这些方法的具体不足主要体现在1.量化指标缺乏药效评价虽然采用了一㈣方便、有效的评价指标,如体重、血压、 血糖、转氨酶、血小板、细胞数目等，但还有许多药物的药效缺乏明确量化指标，以现有的方 法难以实施精确检测和评价。例如疲劳程度、疼痛程度和镇痛效果、机体排斥反应的强弱和 免疫抑制剂的效果，兴奋、焦虑或作用于精神、神经类药物的药效，心肌收缩力或胃肠道运 动是加强还是减弱；血管或支气管是扩张还是收缩等。2.因缺乏客观定量指标，许多药效的评价只能采取主观的人为评价或定 性，对这些药效的评价不得不依靠定性方法(如组织切片、成像技术、各种电镜检查等)或 经验判断或主观感觉进行分级量化，使得药效评判存在很大的主观性和不确定性。3.片面件许多指标存在一定的片面件，R是反映了个别牛化功能、器官/组织的 状态，缺乏整体的、系统的评价标准。如转氨酶、肌酸酐、血沉等指标。4. 性一些评价方法对机体伤害大或费用昂贵，如活检、介入、造影、断层扫描 等，缺少损伤性小、经济方便的方法。总之，现有的许多药效评价的方法局限性较大，缺乏定量标准、缺乏客观性、全面 性、针对性和创新性，不利于对药效进行定量、客观和准确评价，成为严重制约药理学研究 的巨大障碍和困扰药理学研究的重大难题。亟需研究和创立方便、合理、应用广泛的新药效 评价方法。机体内源性小分子物质组是生命活动的基础，机体的功能状态必然反映在体内代 谢组(内源性小分子化合物总称)上。研究表明，在疾病状态下机体代谢功能和很多小分 子化合物水平明显异常。而在药物治疗和机体康复过程中，随着机体的各项功能逐渐恢复， 体内小分子和代谢水平也逐渐得到调节或纠正。而代谢组调节或转归的程度与药效强弱之 间具有显著的相关性，即药效越强、越好，机体的各项功能状态/体内小分子水平也越接近 正常(远离疾病状态)；药效越弱、越差，机体的各项功能状态/体内小分子水平也越靠近 疾病状态(远离正常状态)。利用合适的代谢组学检测工具，可以检测生物样本中数百甚至上千个分子量小 于1000的各类小分子化合物。以GC/T0FMS测定为例，对很多化合物检测灵敏度高达 10_12mol (绝对检测限)，相对灵敏度达10_9mol/mL。这些化合物包括几乎所有氨基酸、糖醇 类化合物、脂肪酸类、脂类、小分子有机酸类、核苷和嘌呤化合物、氨类化合物、神经递质等 等，它们既是生命活动必需的原料，也是机体代谢产物/中间体，还是机体生长、发育、生物信号传导和代谢循环的重要物质基础。与生命活动中起着极为重要作用的糖代谢、脂代谢、 三羧酸循环、尿素循环、氨基酸循环等密切相关。因此，检测的体内小分子的变化既可以系 统综合地体现药效作用的结果，还可以根据给药前后样品移动距离定量评价药效。迄今为 止，还没有利用代谢组学数据建立数学模型、计算给药组与对照组相对距离对药效进行定 量评价的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是利用代谢组学方法，全面、定量测定生物样本中内 源性小分子，得到的数据采用多变量数据处理方法建立数学模型，计算给药组与对照组的 相对距离，以此定量数值作为药效评价的指标，解决许多药效缺乏准确定量评价方法的问 题。为解决上述问题，本发明提供如下技术方案，步骤包括样品采集和处理采集临床病人、模型动物、组织/细胞等各类生物样本，通常为 血液、尿、体外培养的细胞或培养液；样品经过有机溶剂进行液_液提取，有机溶剂包括乙 酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈；或经过蛋白沉淀，蛋白沉淀的方法包 括加入有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)、各种酸碱盐沉淀、加热沉淀、过滤/超 滤、固相萃取等方法单独或者综合的方式进行处理；样品可不进行干燥，或先干燥再利用各 类含有机溶剂和水相(单独或者综合，含盐或者不含盐)的溶媒溶解；样品不进行衍生化或 者利用试剂进行衍生化处理。样品分析和数据处理采用基于质谱测定与色谱联用的技术方法或核磁共振技术 的测定方法对上述样品进行检测，这些方法可以是液相色谱_质谱、气相色谱_质谱、毛细 管电泳色谱-质谱、核磁共振等；经过数据处理后得到色谱图中各个峰的定量数据，这个数 据可以是峰面积或峰高，或由峰面积或峰高计算得到的定量数据。本发明的一个突出优点是上述检测方法能检测体内大量小分子化合物，并以此为 基础全面评价药物作用效果/或机体的健康状态。当药效作用强时，整个代谢谱接近正常， 而药效较弱时，代谢谱改变不明显。图1给出了高血压大鼠(SHR)和正常大鼠(WKY)(血清 样本)的GC/T0F-MS测定总离子流色谱图，从色谱图中可以看出，两种大鼠的总离子流图存 在差异，但这种目测观察的方法只能作一个粗略、主观的判断，无法实现定量评价。数学模型建立和相对距离值的计算上述数据采用各种多变量数据处理软件，可 以为SPSS、Mat lab、SIMCA-P等，选择偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二 乘法(0PLS)、正交偏最小二乘法-判别分析(0PLS-DA)、主成分分析(PCA)、非线性映射 (Nonlinemapping, NLM)、聚类分析(HCA)等方法建立数学模型，获取模型参数和样品在多 维数学模型中的空间坐标，计算给药组样品与对照组相对距离。这里的多维空间可以是1、 2、3维，也可以是4、5、6甚至更多维空间。上述对照组可以是给药前自身对照，也可以是未 给药的模型组平行对照，还可以是未给药的正常组对照。上述空间相对距离可以先取各组 样品的坐标平均值，再计算得到，也可以先计算各个样品之间距离，再取平均值得到。采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法_判别分析(PLS-DA)等投影分析的方法的 突出优点是能方便、直观地观察各个样品在多维空间模型中的相对位置，图2显示人参总 皂苷给药能对高血压模型大鼠(SHR)体内异常的代谢状态进行调节，使之逐渐趋近于正常大鼠(WKY)，体现药物对高血压大鼠代谢组的调节和纠偏作用。与上述总离子流图一样，这样目视观察的方法虽然被大量用于药效的定性评判， 但其主要问题是无法量化，且结果判断带有主观性。本发明的有益效果由于疾病状态下机体代谢功能和小分子水平异常，在代谢组学上的表现就是远离 正常组。经过药物治疗，机体逐渐康复，代谢组学表现为接近正常、远离疾病；药效越强，越 接近正常、远离疾病；而药效越弱则远离正常、接近疾病。1.利用代谢组学研究结果可以定量反映了药物药效，增强了客观性和准确性，避 免了 一些药效指标只能采用人为和主观判断的问题。2.利用代谢组学研究结果可以全面综合地反映药物药效，避免了一些药效指标只 反映局部药效的问题。3.代谢组学的量化指标适用面广，可适用于各类疾病药效的定量评价。4.代谢组学的药效评价方法采用血浆、尿等样本，成本低、对机体伤害小。
图1GC/T0F-MS测定高血压大鼠(SHR)和正常大鼠(WKY)的总离子流色谱图，从色 谱图中可以看出，两种大鼠的总离子流图存在差异，但这种目测观察的方法只能作一个粗 略、主观的判断，无法实现定量评价。图2人参总皂苷给药组、高血压对照组和正常对照组在0、2、4、6、8周样品分布散 点图。人参总皂苷对高血压大鼠不但显示出明显的降压作用，而且经过8周给药，能对高血 压模型大鼠(SHR)体内异常的代谢状态进行调节，逐渐趋近于正常大鼠(WKY)，从直观上可 以看出药物对高血压大鼠代谢组的调节和纠偏作用。与上述总离子流图一样，这样目视观 察的方法虽然被大量用于药效的定性评判，但其主要问题是无法量化，且结果判断带有主 观性。
具体实施例方式本发明通过下面的实施例进行详细的解释，但并不意味着本发明仅限于此。实施实例人参总皂苷对高血压大鼠代谢组的调节作用1.实验方案和样品采集8周龄自发性高血压大鼠(SHR)适应性饲养两周，从第10周开始给予人参总皂苷 30mg/kg/d(i.p)，至18周停止给药，停药后2周内继续测定血压。另外一组SHR大鼠和正 常大鼠(WKY)给予以生理盐水作为模型对照和正常对照。每周尾套法测各组血压，每两周 采血一次，每次0. 3ml，血液在37°C水浴静置lh，3500rpm离心后收集上层血清，-80°C保存， 一部分用于血清生化分析，另一部分用于代谢组学的测定，采血前大鼠禁食12小时。结果血压测量结果显示正常WKY大鼠在实验期间内血压保持正常平稳，高血压 SHR大鼠血压显著高于正常大鼠(p < 0. 01)，并有持续缓慢升高趋势，而人参总皂苷给药组 血压逐渐缓慢下降，即使停药2周血压仍然维持在较低水平，显示出持久的降压作用。人参 总皂苷给药组、高血压对照组与正常对照组血压测定结果见表1。
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2.样品处理冷冻血清在37°C水浴解冻20min，涡旋振荡后，取50 yl加入200 u 1含有稳定 同位素13C的内标肉寇酸的甲醇溶液(12. g/ml)，涡旋振荡3min，4°C冰箱静置1小时， 19600g和4°C离心lOmin，取lOOiil上清液于GC小瓶中，减压挥干。向GC小瓶中加入30yl 甲氧胺吡啶溶液(10mg/ml)，涡旋振荡3min，室温下静置16h进行肟化。加入30 yl三甲基 硅烷基三氟乙酰MSTFA (含1 % TMCS作为催化剂)，涡旋振荡lmin，室温静置lh进行衍生化 反应，最后再加入30 u 1外标甲基肉寇酸酯的庚烷溶液(30 u g/ml)，混合后进行GC-T0F/MS 检测。3. GC/T0F-MS 测定仪器气相色谱-飞行时间质谱(GC/T0F-MS)检测系统(GC :Angilent 6890N气相 色谱仪，配备Angilent 7683B自动进样器和G2614A型100位样品进样盘；TOF-MS :Pegasus III，Leco, USA)。色谱条件色谱柱是DB-5石英毛细管柱(10mX0. 18謹i. d.，J&ff Scientific, USA)，进样量lyl，采用不分流进样模式；载气氦气；恒流速度lml/min ；程序升温模 式70°C保持2. Omin，然后以35°C /min线性勻速线性升温至305°C，保持2. Omin。质谱条件进样口温度250°C ；清洗时间和流速lmin，20ml/min ；传输管温度 250°C ；离子源温度200°C ；离子源电压和电流_70eV，3. OmA ；MS采用全扫描方式进行数据 采集，MS采用全扫描方式进行数据采集；扫描范围m/z 50-800 ；扫描速度20Spectra/S ； 检测电压为-1690v。测定结果在上述检测条件下可获得样品的GC/T0F-MS总离子流色谱图(图1)。 利用仪器自带的软件(ChromaTOF 2.00)可提取各个测定样品色谱图中每个色谱峰峰面 积，组成一个由峰面积组成的数据矩阵，该数据矩阵包括人参总皂苷给药组、高血压模型组 及正常组共84个样品(为第一列)和154个色谱峰(为第一行)，保存在excel文件中。4.数学模型建立和相对距离值的计算将上述数据调入多元数据分析软件SIMCA P-ll(Umetrics AB，UmeS，瑞典)中，利 用数据内在关系投影-偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)计算数学模型，确定模型的主成分 数目为2，该数学模型即为一个2维空间模型，每个样品都是此空间中的一个点，其位置由x 和y坐标参数所决定。由上述模型可以得到各个样品在此模型的平面坐标中的分布图，图 2。提取每个样品在模型中的空间坐标参数，按照下列公式(1)计算每组样品x和y 坐标的平均值，再按照公式(2)、(3)计算给药组与未给药的高血压对照以及未给药的正常 对照组之间距离。另外，按照公式(4)可以计算出给药组与同期高血压模型组及正常组距 离的相对比值，表示用药对高血压大鼠体内代谢组的调节程度/即药效强弱。公式1 Xi = (Xil+Xi2+Xi3+Xi4+Xi5+Xi6)/6Yi = (Yil+Yi2+Yi3+Yi4+Yi5+Yi6)/6Xi、Yi分别为给药组第i周横坐标和纵坐标平均值。其中Xil 6为1 6号样 品横坐标值；Yil 6为1 6号样品纵坐标值。公式2
0131.7±1131.8士2128.3士3124.2±4123.3士5125.5±6124.6±7128.2士8120.5±9121.3土10128.3士
178.4士7.3183.3士7.7185.7士10.2189.3土7.7187.8士4.3191.5土4.4192.8士4.6193.0±5.0196.5土6.2197.3±9.4199.2士7.6
179.5土7.8186.4士9.4175.1士15.6177.7士9.4183.7士6.1*182.3士5.3**179.9士4.1**173.0士7.8**170.0土10.4 *176.6土8.0**183.9±6.0 **表2人参总皂苷给药组(TG)与同期高血压模型组(SHR)、正常组(C)之间相对距 离Sim = [ (Xi-Xim) 2+ (Yi-Yim)2]1/2Sim为给药组与未给药的高血压模型(对照)组距离；Xim、Yim分别为第i周未给 药的高血压模型(对照)组X、Y坐标平均值。公式3 Sic = [(Xi-Xic)2+ (Yi-Yic)2]1/2Sic为给药组与未给药的正常对照组距离；Xic、Yic分别为第i周未给药的正常对 照组X、Y坐标平均值。公式4 Rd = Sim/SicRd为给药组与同期高血压模型组及正常组距离的相对比值；Sim为给药组与未给 药的高血压对照组距离；Sic为给药组与未给药的正常对照组距离。按照上述公式可以分别计算出给药组与未给药的高血压对照组距离、给药组与未 给药的正常对照组距离以及给药组与同期高血压模型组及正常组距离的相对比值，结果见 表2。由表2给药组与同期高血压模型组或正常组距离结果可知，高血压大鼠给药后2、4、 6、8周，从初期靠近高血压模型对照组、远离正常对照组，逐渐转变为远离高血压模型对照 组、接近正常对照组。从给药组与同期高血压模型组及正常组距离的相对比值可更加明显 看出给药后高血压大鼠逐渐远离高血压组、接近正常对照组，因此该相对距离方法明确定 量地表示了药物对体内代谢组调节的强弱，即定量反映了药效作用。表1人参总皂苷给药组、高血压对照组与正常对照组血压平均值(mmHg，n = 6)
实验时
间正常对照组高血压对照组 人参总皂苷给药组
周 Mean 士 SDMean 士 SDMean 士 SD
o o 9 7 8
0.石 1.2.3 1. l,.oi C5.0 13416619116
7组别平均坐标 给药组与同期高给药组与同期高血压
血压模型组或正 模型组、正常组距离
周(n-6)XiYi .常组距离的相对比值2给药高血压大鼠2.35-2.094给药高血压大鼠-1.021.276给药高血压大鼠-0.804.468给药高血压大鼠-2.486.510正常大鼠(对照)-4.84-5.762正常大鼠(对照)-4.89-5.758.114正常大鼠(对照)-4.04-0.883.716正常大鼠(对照)-6.282.895.708正常大鼠(对照)-7.713.176.200高血压大鼠(对照)5.74-3.8110. 76*2高血压大鼠(对照)3.92-3.221.940. 2394高血压大鼠(对照)3.84-1.325.511.4856高血压大鼠(对照)5.322.186.531. 1468高血压大鼠(对照)10.713.8713.462. 170
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权利要求
一种应用代谢组学技术进行药效定量评价的方法所依赖的是仪器测定所得到的代谢组学数据，其特征包括以下几个方面a)采用血清作为样本进行检测；b)采用甲醇沉淀蛋白的方法对血清中小分子进行提取；c)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法对样本进行衍生化；d)采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/TOF-MS)进行样本分析；e)应用SIMCA P-11软件和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)建立数学模型；f)从多维空间数学模型中提取参数，计算用药组和对照组之间相对距离。
2.除权利要求1中血清作为生物样本外，生物样本还可来源于人、动物、细胞、组织等， 具体包括全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、泪液、汗液、组织勻浆、细胞或细胞培养液。
3.权利要求2中上述生物样本至少其中一组为用药后采集生物样本(给药组)，一组 为对照组；对照组可以是给药前自身对照，也可以是未给药的模型组平行对照，还可以是未 给药的正常组对照。
4.除权利要求1中甲醇沉淀蛋白的方法处理生物样本外，还包括经过其它蛋白沉淀方 法，如加入有机溶剂(如乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)、各种酸碱盐沉淀、微波、加热沉淀的方 法；或经过有机溶剂进行液-液提取，有机溶剂包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、 二氯甲烷、苯、正己烷、环己烷、乙腈；或过滤/超滤的方法；或固相萃取方法；或生物样本不 经过前处理的方法。
5.除权利要求1中采用气相色谱-飞行时间质谱(GC/T0F-MS)进行样本分析外，还包 括其它任何基于质谱测定技术、核磁共振测定技术和其它代谢组学测定技术的分析方法。
6.权利要求1中所得到的数据可以是绝对定量数据，也可以半定量数据，如峰面积、峰 高，或由此采用数学方法计算得到的数据。
7.除权利要求1中应用SIMCAP-11软件和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)建立 数学模型的方法外，还包括其它代谢组学数据处理软件，如SPSS、Matlab、SIMCA-P等各 类版本；包括选择除偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)外的其它方法，如正交偏最小二 乘法(0PLS)、正交偏最小二乘法-判别分析(0PLS-DA)、主成分分析(PCA)、非线性映射 (N0nlinemapping，NLM)、聚类分析(HCA)等方法建立数学模型。
8.权利要求1中的数学模型可以为任意维空间模型，这里的多维空间可以是1、2、3维， 也可以是4、5、6甚至更多维空间。
9.权利要求1中用药组和对照组之间相对距离可以有两种计算方式，先取各组样品的 坐标平均值，再计算得到；在有自身对照样品时，也可先计算每个样品给药前后变化距离， 再取平均值得到。
10.权利要求9中药效表示可以采用药组和对照组之间相对距离，也可以是相对距离 的函数计算值，如常有对数值、自然对数值、平方值、平方根值等任何数学计算方式所得结
全文摘要
本发明公开了“一种应用代谢组学技术定量评价药效的方法”。其特征在于利用基于质谱、核磁共振等测定技术的代谢组学方法全面、定量测定生物样本中小分子化合物，再采用多变量数据处理方法建立多维空间数学模型，计算给药组与对照组的相对距离，以此作为药效评价的定量指标，解决许多药物药效评价中缺乏定量评价指标的难题。与常规药效评价的方法相比，该方法适应面广、灵敏、取样简便、对机体无伤害，更全面、综合地体现了药效作用，可以为新药研发和药理研究中的药效评价提供一种全面、可靠的定量评价方法。
文档编号G01N30/72GK101799462SQ20101014186
公开日2010年8月11日 申请日期2010年4月8日 优先权日2010年4月8日
发明者严蓓, 刘林生, 张颖, 曹蓓, 李梦婕, 查伟斌, 王广基, 王新文, 石建, 赵春艳, 郑天, 阿基业, 陆益红, 顾胜华, 黄青, 龚平 申请人:中国药科大学