一种蓝鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，特别涉及一种蓝鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系及应用。引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。采用蓝鳕鱼特异性检测引物进行实时荧光PCR扩增蓝鳕鱼的CoⅠ基因，实时荧光PCR扩增后会产生一条特异性扩增曲线，从而将蓝鳕鱼成分进行特异性鉴定。本发明特异性引物设计合理，用于蓝鳕鱼的物种检测，特异性好，检测灵敏度高，即经过荧光PCR分析，即可将蓝鳕鱼成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【专利说明】
-种蓝輯鱼实时黄光PCR特异性检测体系及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及一种蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体 系及应用。
【背景技术】
[0002] 蓝轄鱼（学名：Mic;romesistius poutassou)为轄形目轄科鱼类的一种，夕F表粗糖。 通过形态学特征进行判断是对蓝轄鱼识别的传统方法，但是运些形态学特征的可塑性强， 受环境影响大，具有人为的主观倾向性，且存在丰富的近缘物种，近缘种间的形态差异细 微，所W传统的形态学特征识别方法存在识别困难与识别错误的问题。
[0003] 采用DNA技术鉴定动物物种是物种识别方法中最为热口也是发展最快的分子技 术，快速进化并呈母系遗传的线粒体DNA是种群遗传学和进化遗传学的理想研究对象。目 前，鱼类物种的分子检测主要集中CoI基因，蓝轄鱼与其它近源物种的CoI基因序列相似度 在90%左右，序列之间存在着一定的差异。实时巧光PCR是DNA技术鉴定中快捷高效的技术 之一，指在DNA扩增反应中，通过巧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物 总量的方法，研究利用实时巧光PCR对蓝轄鱼进行物种识别及在蓝轄鱼的物种保护及系统 发育研究等领域均具有重大意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种蓝轄鱼物种特异性检测体系及该特异性检测体系的应用方法。本 发明可W检测出来自动物样品的微量DNA，完全区分蓝轄鱼的基因与其它鱼类基因，检测灵 敏度高，方法快速，易操作。
[0005] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是:一种蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异 性检测引物和检测体系，其中所述的引物序列是：
[0006] 上游引物沈Q ID NO. 1:5 ' -CAGTAGGAGGGCTAACAG-3 ' ；
[0007] 下游引物沈Q ID NO. 2:5 ' -GGAATCAATGGACGAAGG-3 ' ；
[000引进一步地，所述蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系还包括由其他试剂所组 成的反应体系如下表1:
[0009] ± 姑位4如王丄山以A化口,化认.'化1化 < 占片r-~山<
[0010]
[0011]
[001^ 其中，SYBRBipremix Ex hq购自于大连宝生物工程郁良公司（商品货号:RR820)
[0013] 进一步地，所述蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表2:
[0014] 表2蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系的反应参数
[0015]
[0016] 一种根据所述的蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系的应用，利用SYBR|，> Green I与双链DNA非特异性结合的特性，监测每一PCR反应的巧光强度，W检测反应体系中 的DNA扩增产物。
[0017] 进一步地，所述蓝轄鱼物种进行实时巧光PCR特异性检测方法为:采用蓝轄鱼物种 实时巧光PCR特异性检测体系扩增蓝轄鱼的CoI基因，WSYBRi'Premix Ex化q DNA聚合酶 进行PCR反应，利用SY日R?Green I与双链DNA结合后发出巧光的特性，检测反应体系中的 SYBR?Green I与DNA结合后发出的巧光，达到检测PCR产物扩增量目的。通过设计蓝轄鱼 物种特异性引物，从而引发特异性扩增，通过巧光信号的收集处理，获得特异性扩增曲线。 [00 1引本发明特异性引物设计合理，用于蓝轄鱼物种检测，特异性好，检测灵敏度高。采 用本方法检测蓝轄鱼动物成分结果显示，采用蓝轄鱼物种特异性检测引物实时巧光PCR扩 增蓝轄鱼的CoI基因，会产生一条特异性扩增曲线，即经过实时巧光PCR分析，即可将蓝轄鱼 成分进行准确鉴定，具有很好的特异性。
【附图说明】
[0019] 图1.相似序列的物种分布情况，其中，方框内的物种为蓝轄鱼所在的位置；
[0020] 图2.引物的特异性分析，如图所示只有Micromesistius poutassou的物种能和所 设计的引物完全互补结合，没有检验到完全匹配的其它物种，证明引物的特异性较好；
[0021] 图3.引物PCR扩增的电泳检测结果图，图中：M、DL2000marker; 1、蓝轄鱼2、蓝轄鱼 3、太平洋轄鱼4、黑线轄5、大西洋轄6、阿拉斯加轄鱼7、空白对照。
[0022] 图4.蓝轄鱼实时巧光PCR的溶解曲线检测结果图，图中：1、蓝轄鱼2、蓝轄鱼3、太平 洋轄鱼4、黑线轄5、大西洋轄6、阿拉斯加轄鱼7、空白对照。
[0023] 图5.蓝轄鱼与其他轄形目海洋鱼类的实时巧光PCR特异性检测结果图，图中：1、蓝 轄鱼2、绿青轄3、太平洋轄鱼4、北太平洋无须轄5、黑线轄6、大西洋轄7、黑轄8、阿拉斯加轄 鱼9、空白对照。
[0024] 图6.灵敏度分析结果图，图中：1、25ng/iiL扩增结果;2、5ng/iiL扩增结果;3、lng/化 扩增结果;4、0.2ng/iiL扩增结果;5、0. (MngAiL扩增结果;6、0.0 lngAiL扩增结果;7、空白对 照。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。本发明下述具体实施例中所设及的实验方法如无特殊说明，均为实验室常规方法，所用 的试剂或药品，如无特殊说明，均由常规方法制备或者可由商业途径获得，其中所用空白对 照为水。
[0026] 实施例1巧光PCR特异性检测引物序列的设计
[0027] 1.蓝轄鱼相近物种CoI基因的分析
[002引登录NCBKhttp://www.ncbi .nlm.nih.g N程序在nr数据库中进行相似性序列的 捜索，返回的相似序列的物种分布情况如图1所示，并将所有序列WMicromesistius poutassou及CoI为关键词在nr数据库中进行捜索，将捜索结果的序列下载存盘后，进行 Blast列下载存盘。图1为相似序列的物种分布情况，其中，方框内的物种为蓝轄鱼所在的位 置。
[0029] 2.蓝轄鱼物种特异性检测引物的设计
[0030] 将下载的序列进行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差异处设计特异性 引物。
[0031 ] 3.蓝轄鱼物种特异性检测引物的特异性分析
[0032] 将设计好的引物在NCBI中，利用primer blast程序选择nr数据库，进行引物的特 异性分析，如图2结果所示：在返回的结果中，只有Micromesistius poutassou的物种能和 所设计的引物完全互补结合，没有检验到完全匹配的其它物种，证明引物的特异性较好。
[0033] 4.蓝轄鱼物种特异性检测引物合成
[0034] 在宝生物公司合成蓝轄鱼物种特异性检测引物1对，其序列为：
[0035] 上游引物沈Q ID NO. 1:5 ' -CAGTAGGAGGGCTAACAG-3 ' ；
[0036] 下游引物沈Q ID NO. 2:5 ' -GGAATCAATGGACGAAGG-3 ' ；
[0037] 5.蓝轄鱼DNA的提取
[0038] 采用DNA提取试剂盒(购于宝生物公司）提取蓝轄鱼(取自大连国富水产食品有限 公司）模板DNA，用微量分光光度计检测提取蓝轄鱼模板DNA的浓度为10化邑。
[0039] 6.蓝轄鱼CoI基因的克隆及测序验证
[0040] 琼脂糖凝胶电泳检测：W合成的特异性引物PCR扩增蓝轄鱼的CoI基因后，W2%琼 脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示（如图3所示），经琼脂糖凝胶电泳检测后会分别产生 147bp的特异性电泳条带，电泳效果最好，PCR扩增效率最高。
[0041] 片段的切胶回收:采用宝生物公司的DNA片段回收试剂盒将目的条带回收及纯化， 操作过程按试剂盒附带的说明书进行。
[0042] 回收片段的连接、克隆及测序：回收片段与克隆载体PMD-19T连接，转化，经菌液 PCR检测，阳性菌株送上海生物工程有限公司进行序列测定，确定所克隆的目的片段的序列 信息。
[0043] 序列验证:测序结果采用NCBI的Blast N程序通过序列比对进行验证，验证结果显 示，所克隆的片段为蓝轄鱼的CoI基因片段。
[0044] 实施例2实时巧光PCR特异性检测体系的应用
[0045] 蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系的应用，即利用所述蓝轄鱼物种实时巧 光PCR特异性检测体系扩增蓝轄鱼的CoI基因，对蓝轄鱼物种进行实时巧光PCR特异性检测， 具体步骤如下：
[0046] 亲3胺値值物!釉出时忠弈PCR赔見化捻畑Il化器的!^廊化器
[0047]
[004引蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系的反应参数如下表4:
[0049] 亲4苦値值物釉违时巧朵PCR特异忡捻細Il化累的反应参数
[(K)加]
[0051] 采用蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测组合物进行实时巧光PCR扩增蓝轄鱼的 CoI基因时，WsYBR?Premix Ex hq DNA聚合酶进行PCR反应，利用SYBRgiGreen I与双链 DNA结合后发出巧光，检测反应体系中的SYBR?Green I与DNA结合后发出的巧光，通过设 计蓝轄鱼物种特异性引物，从而引发特异性扩增，通过巧光信号的收集处理，获得特异性扩 增曲线，如图4及图5所示，证明了所设计引物进行PCR扩增的有效性及特异性的结果。
[0052] 实施例3特异性检测
[0053] 利用所述蓝轄鱼物种实时巧光PCR特异性检测体系进行蓝轄鱼的物种成分实时巧 光PCR特异性检测蓝轄鱼等轄形目样品，采用DNA提取试剂盒提取各待测样品的模板DNA，用 微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA的浓度为SOngAiL,分别按照上述步骤4中所述 反应体系及反应参数进行PCR扩增，产生的30个循环W下的特异性扩增曲线即为蓝轄鱼，其 他样品在30个循环W后出现扩增曲线或没有扩增曲线，此方法可W准确的对蓝轄鱼的成分 进行鉴定，具有很好的特异性，如图5所示。
[0054] 实施例4灵敏度检测
[0055] 采用DNA提取试剂盒提取阳性样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取 的模板 DNA 梯度稀释，制备成 25ngAiL、5ng/iiL、IngAiUO.化g/iiL、0.04ngAiL、0.0 lngAiLS 个 浓度梯度样品，分别按照上述步骤3中所述反应体系及反应参数进行实时巧光PCR扩增，W 确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图6所示，所产生特异性扩增曲线即为蓝轄鱼，当DNA 浓度^ 0. (MngAiL时均可W特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为0.04ngAiL。此方法可 W准确的对蓝轄鱼的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。
[0056] W上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的 具体实施仅限于运些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明 的构思的前提下，还可W做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种蓝鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测引物，其特征在于：引物序列如SEQ ID NO .1 和SEQ ID NO .2所示。2. -种蓝鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于:包括如权利要求1所述 的引物。3. 根据权利要求2所述的一种蓝鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系，包括下述试 剂： 2X 泫改的 SYBRk Pranix Ex Taq 12 5 μ L 浓度为Η) μ mol/L的上游引物SEQ ID Ν0.1 (X25 μ L 浓度为 10 μ mol/L 的下游引物 SEQ ID Ν0.2 :(),25 U L。 浓度<50ng的待检样品的DNA模板 1 μL. 双蒸水 11 PL4. 根据权利要求2所述的一种蓝鳕鱼物种实时荧光PCR特异性检测体系，其特征在于： 所述检测体系的反应参数为:变性，95°C，30s;扩增，95°C，5s; 60°C，30s，40个循环。5. 利用权利要求2所述检测体系对蓝鳕鱼物种进行实时荧光PCR特异性检测。
【文档编号】C12Q1/68GK105838788SQ201610204804
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】蒋丹, 刘淑艳, 刘冉, 苏旺
【申请人】蒋丹, 刘淑艳, 刘冉, 苏旺