一种实时荧光pcr检测鼠痘病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属检测领域，涉及核酸检测方法，具体涉及一种实时荧光PCR检测鼠痘病 毒的方法。
【背景技术】
[0002] 鼠痘病毒（Poxvirusofmice)又名小鼠脱脚病病毒（Ectromeliavirus),在分类上 属于痘病毒科(Poxviridae)正痘病毒属。由鼠痘病毒引起的小鼠鼠痘是一种高度接触性、 毁灭性的烈性传染病，临床以四肢、头和尾肿胀、坏死甚至脚趾脱落为特征，是危害小鼠最 为严重的病毒病之一，死亡率达96. 6%。研究显示，该疾患对世界各地不同种类和年龄的小 鼠均具有传染性，但其传染强度随毒株不同而异，同时不同基因型的小鼠对其敏感性存在 差异。1929年该疾患首先在英国实验鼠群中发现；在欧洲，野生鼠和其他啮齿类动物能够 感染鼠痘病毒，在试验条件下该病毒很容易在野鼠和实验鼠之间传染。我国1951年首次报 道北京中央生物制品研究所发生鼠痘疫情。1986年和1989年有学者对全国鼠群进行流行 病学调查，证实鼠痘在我国鼠群中呈散发性流行。至今，该疾患在世界各国时有发生，尤以 英德美法最为严重，我国也仍时有发生。该疾患的发生，常造成全群动物淘汰，严重影响实 验动物的生产繁育，影响科研及数据的准确性和可重复性。
[0003] 因鼠痘病毒是一种典型的正痘病毒，与牛痘病毒有交叉抗原，故本领域早期常用 牛痘病毒替代鼠痘病毒作为抗原检测鼠痘病毒抗体。常用的鼠痘病毒血清学检测方法有： 血凝抑制试验（HI)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、免疫荧光试验（IFA)、免疫酶试验（IEA) 等。HI是上世纪80年代国内普遍采用的鼠痘抗体检测方法，其简易快速，但存在假阴性，敏 感性不高，现在较少使用；IEA方法操作简单、敏感，无需昂贵的仪器，但其特异性不如IFA ; IFA法敏感度高、特异性强、简易快速，且检测试剂制备简单，结果易于判断，是实验室检测 鼠痘的首选方法之一;ELISA具有快速、简便、敏感的特点，是近年来常用的鼠痘病毒血清 学检测方法。由于小鼠感染鼠痘常为无临床症状的隐性感染，动物不显现任何临床症状。 隐性感染的带毒鼠是主要的潜在疫源容易在鼠群中传播，一旦实验小鼠的饲养条件发生改 变，或受到物理、化学、生物因子等的刺激，隐性感染被激发，则引起鼠痘的发生和流行；即 使动物体内携带的鼠痘病毒未被激化引起发病死亡，也可能干扰实验结果和准确性。通常， 鼠痘隐性带毒鼠的血清抗体水平较低，常用的血清学检测方法时有造成漏检。因此，研制新 的灵敏度高的鼠痘病毒核酸检测方法，对控制隐性感染野生及实验用噬齿类动物中鼠痘病 毒的传播具有重要的意义。本申请的发明人拟提供一种实时荧光PCR检测鼠痘病毒的方 法，以快速，灵敏，可靠地检测鼠痘。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供用于鼠痘特异性检测快速灵敏 的方法，具体涉及一种实时荧光PCR检测鼠痘病毒的方法。
[0005] 本发明方法基于鼠痘病毒血凝素（Hemagglutinin)基因序列设计了特异性的引物 和Taqman探针，可用于快速、特异和高灵敏度地检测噬齿类实验动物和野生动物中鼠痘感 染的情况，为鼠痘的临床诊断、流行病学调查及疫情防控提供参考依据。
[0006] 具体的，本发明的实时荧光PCR检测鼠痘病毒的方法，其特征在于，其包括步骤：
[0007] (1)标本采集
[0008] 鼠患部皮肤渗出液、肝、脾、中枢神经、淋巴结、肺、血液、腹水、小肠等组织器官；组 织样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检；血液和腹水直接 用于检测；
[0009] (2)设计引物和荧光探针
[0010] 收集Genbank库中收录的不同国家和地区分离的鼠痘病毒血凝素基因编码序列， 使用VectorNTISuite软件分析其保守序列，用PrimerExpress软件设计引物和TaqMan MGB 探针；
[0011] 所述引物和探针可采用本领域已知的方法进行合成制备；
[0012] 本发明的实施例中，所述引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成；
[0013] (3) DNA 抽提
[0014] 采用 QIAampDNABloodminikit (QIAGEN51106)提取病毒基因组 DNA :取 200 μ L 待 检上清液或血清，加入20 μ L蛋白酶K混匀，再加入200 μ L裂解缓冲液AL，于56°C水浴 中孵育lOmin，将溶液加入吸附柱中离心，加入缓冲液AWl洗1次，再加 AW2洗1次，最后用 50 μ 1三蒸水洗脱DNA。
[0015] (4) Real-timePCR 检测
[0016] 按如下配置反应体系：10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5yL、dNTP0.5yL、Taq酶 0· 25 μ L、模板 1 μ L、上下游引物（TEVF、TEVR)各(λ 25 μ L、TaqMan 探针（TEVP) (λ 25 μ L，加 水补足总体积至25 μ L ;
[0017] 其中，反应条件为：首先95°C 3min ;然后95°C 15s，58°C 45s，运行40个循环，并在 58°C进行荧光信号采集；反应在实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems，ViiA?7系统或 相同功能的荧光PCR仪）上进行；
[0018] 本发明所涉及的引物和探针序列如表1所示，
[0019] 表1引物和探针序列
[0020]
[0021] 其中，*参考鼠痘病毒血凝素基因的保守序列（GenbankNo. AF375091);
[0022] (5)评估 Real-timePCR 的特异性
[0023] 选取鼠痘病毒标准株感染的阳性临床样本及其它鼠病毒临床样本(如：小鼠 肝炎病毒（Mousehepatitisvirus，MHV)、小鼠肺炎病毒（Pneumoniavirusofmice，MPV)、 仙台病毒（Sendaivirus，SV)、呼肠孤病毒3型（Reovirustype3，Reo_3)、小鼠细小病毒 (Parvovirusminutevirusofmice，MVM)等），以验证该 Real-timePCR 方法的特异性：首先米 用QIAampDNABloodminikit (QIAGEN51106)提取上述病毒临床样本的基因组DNA，再以上述 基因组DNA为模板进行real-timePCR，观察扩增曲线；
[0024] (6)评估 Real-timePCR 的灵敏度
[0025] 评估该PCR方法的灵敏度，将提取的鼠痘病毒DNA进行定量，制作成标准品进行 Standardcurve实验：首先微量紫外分光光度计（Thermo, NanoDropND-2000C)对鼠痘病毒 DNA进行核酸定量，然后进行10倍模板稀释，制备成浓度分别为IOng/μ L、Ing/μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/ μ L的标准品，再以所述标准品为模板 进行 Real-timePCR，获得 Standardcurve ;
[0026] (7)评估Real-timePCR检测临床标本的可靠性
[0027] 对不同时期和地域收集到的6份鼠痘病毒阳性临床样本及94份鼠痘病毒感染呈 阴性的小鼠组织标本，进行DNA提取，然后采用新建立的鼠痘病毒Real-timePCR方法进行 检测，以验证新荧光PCR方法的准确性和可靠性；
[0028] 本发明中，通过灵敏度和特异性实验，结果显示，所述的实时荧光PCR检测鼠痘病 毒的方法，能稳定和有效地扩增鼠痘病毒特异性基因片段，最高检测灵敏度能达到IO-Ifg/ μ L ;且该方法的特异性高，未观察到假阳性的结果；表明本发明方法检测鼠痘快速，灵敏， 可靠。本方法可进一步用于大规模标本的实验室检测，及用于鼠痘的流行病学的监测工作， 有助于对噬齿类实验动物和野生动物中鼠痘感染疫情作出早期快速诊断。
【附图说明】
[0029] 图1显示了 Real-timeRT-PCR方法检测鼠痘病毒的特异性，其中，
[0030] 阳性扩增曲线为鼠痘病毒；
[0031] 基线下方的曲线分别为MHV、MPV、SV、Reo-3、MVM和空白对照。
[0032] 图2显示了 Real-timeRT-PCR检测鼠痘病毒的敏感性试验，其中，
[0033] 扩增曲线从左至右分别为 IOng/ μ L、Ing/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、 IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/ μ L的鼠痘病毒DNA模板和空白对照。
【具体实施方式】
[0034] 实施例1
[0035] 1、实时荧光PCR检测鼠痘病毒
[0036] (1)采集临床标本
[0037] 鼠患部皮肤渗出液、肝、脾、中枢神经、淋巴结、肺、血液、腹水、小肠等组织器官。组 织样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待检；血液和腹水直接 用于检测。
[0038] (2)设计引物
[0039] 使用VectorNTISuite软件分析不同国家和地区分离的鼠痘病毒血凝素基因的保 守序列，采用PrimerExpress3. 0设计合成鼠痘特异性real-timePCR的引物和探针；引物和 探针由上海辉睿生物科技有限公司合成；
[0040] (3) DNA 提取
[0041] 采用 QIAampDNABloodminikit (QIAGEN51106)提取病毒基因组DNA，取 200μ L待 检上清液或血清，加入20 μ L蛋白酶K混匀，再加入200 μ L裂解缓冲液AL，于56°C水浴 中孵育lOmin，将溶液加入吸附柱中离心，加入缓冲液AWl洗1次，再加 AW2洗1次，最后用 50 μ 1三蒸水洗脱DNA ;
[0042] (4) Real-timePCR 检测
[0043] 按如下配置反应体系：10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5yL、dNTP0.5yL、Taq酶 0· 25 μ L、模板 1 μ L、上下游引物（TEVF、TEVR)各(λ 25 μ L、TaqMan 探针（TEVP) (λ 25 μ L，加 水补足总体积至25 μ L ;
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