检测沙门氏菌及整合子int的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种用于检测沙门氏菌SLM及耐药基因整合子int的引物；本发明还 涉及一种包括上述引物的双重荧光PCR检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检 测沙门氏菌及耐药基因整合子int的方法。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌，拉丁学名salmonella,简称SLM，是引起细菌性食物中毒的主要原因， 当人类食用受污染的食物、未经杀菌或杀菌不彻底的食物时，就可能引起食物中毒，2008年 美国曾爆发沙门氏菌疫情，主要原因是与食用被污染的番茄有关。2009年美国还曾数度召 回被沙门氏菌和大肠杆菌污染的牛肉馅，一些蔬菜沙拉制品也曾因遭大肠杆菌和沙门氏菌 污染被召回。据WHO统计资料表明美国每年仅由于感染沙门氏菌等就造成330-1230万人 患病和约3900人死亡，每年经济损失约为65-349亿美元。
[0003] 我国是抗生素生产和使用大国，每年生产抗生素大约21万吨，除了部分用于出口 外（约3万吨），其余均用于医疗和农业上，我国现有水产养殖面积约573万公顷，其中约30 万公顷是绿色无公害水产养殖面积，在养殖水面禁止使用各种抗生素、激素类药物，在剩下 的约95%水产养殖面积中，为了防止因生物体密度过大而导致疾病的爆发及感染等原因， 盲目的在水中投放抗生素、如土霉素、氯霉素、呋喃唑酮等，混入饵料或直接加入养殖水中 用于治疗或抑制细菌病发生。
[0004] 整合子是近年来发现的新的可移动基因元件，可捕获和整合细菌的耐药基因，在 细菌耐药性的传播和扩散中起到了至关重要的作用。根据编码的整合酶的同源性及捕获基 因盒能力的不同，目前整合子被分成6类，I -III类整合子研宄的较多，其中第I类整合子 最为常见，且多存在于肠杆菌科中。有研宄者分析了来自9个国家14所医院的163株不相 关的革兰阴性杆菌，结果43%的菌株中分离到了整合子。整合子基本结构是由3部分组成， 两端分别是一段高度保守序列conserved segament, Cs，被称为5. Cs和3. Cs，二者之间的 区域称作可变区variable region，可变区有一个或多个外来插入的基因盒组成。整合酶 基因位于整合子的5保守末端，3保守末端结构则因整合子类型不同而异，细菌可以不断的 通过整合酶基因从周围环境捕获耐药基因盒，而具有多重耐药性，而且一个整合子可捕获1 个或多个基因盒，目前己发现了近百种耐药基因盒，覆盖了大多数临床使用的抗生素种类。 因此，整合子的迅速、准确的检出对于耐药菌的控制具有非常重要的意义。
[0005] 传统细菌耐药性检测方法虽然能够满足的部分耐药菌检测需要，但这些方法仍然 存在一些缺点，例如检测时间较长和检测结果不够准确等。因此，随着分子生物学技术的应 用发展，一系列快速细菌鉴定或分子检测技术得到重点关注，这类方法的特点是快速而准 确，一般在几个小时之内就可以得到检测结果，大大缩短了检测时间。针对沙门氏菌和int 相关基因，研宄人员已开展了常规PCR和荧光PCR方法研宄，但常规PCR方法需要PCR扩增 后进行电泳，不仅操作繁琐，而且容易引起污染，还需要使用可能致癌的荧光燃料，而探针 法荧光PCR方法虽然灵敏准确，但是其检测成本较高，而且试剂有效期短，很容易降解。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测沙门氏菌及 耐药基因整合子int的引物；
[0007] 本发明另一个目的是提供一种包含上述引物，且组分和配比合理，使用方便，检测 快捷，准确，适用于双重荧光PCR检测沙门氏菌及耐药基因整合子int的试剂盒；
[0008] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测沙门氏菌及int基因的方法， 该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0010] 一种检测沙门氏菌及耐药基因整合子用的引物，其特征在于该引物的序列分别 为：
[0011] SLM 检测用的上游引物 SLMF :TGCGTCAGGACCTCATAG
[0012] SLM 检测用的下游引物 SLMR :ATGCCTGGAGGAGTGTTT
[0013] int 检测用的上游引物 intF :TTTACGCTGCTGTATGGT
[0014] int 检测用的下游引物 intR :TTATTGCTGGGATTAGGC。
[0015] 一种双重荧光PCR检测沙门氏菌及int基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒中 20 μ L反应体系包括以下组分：
[0016] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOpL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物SLM F 0.05-0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物SLMR 0.05- 0.8 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物int F 0.05-0.9 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物intR 0.05-0.9 μ L DNA模版 I UL 水 补齐至20 μ L ;
[0017] 其中所述上游引物SLMF的序列：TGCGTCAGGACCTCATAG
[0018] 所述下游引物 SLMR 的序列：ATGCCTGGAGGAGTGTTT
[0019] 所述上游引物 intF 的序列：TTTACGCTGCTGTATGGT
[0020] 所述下游引物 intR 的序列：TTATTGCTGGGATTAGGC。
[0021] 本发明试剂盒的优选方案：20 μ L反应体系包括以下组分：
[0022] 终浓度I X的HRM反应预混液 IOpL 终浓度0.5 pmol/L的上游引物SLM F 0.5 U L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物SLMR 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的上游引物int F 0.5 μ L 终浓度0.5 pmol/L的下游引物intR 0.5 μ L DNA模版 I UL 水 补齐至20 μ L 。
[0023] 一种检测沙门氏菌及耐药基因整合子的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0024] A、提取样品DNA ;
[0025] Β、利用如权利要求2所述的试剂盒对步骤A中的样品DNA进行PCR扩增；
[0026] C、扩增后对产物进行高分辨率熔解曲线分析，并结合扩增曲线判定结果。
[0027] 如上所述检测沙门氏菌及耐药基因整合子的方法，其特征在于步骤B中PCR扩增 的反应程序按以下步骤进行：
[0028] (1)92°C ~96°C预变性 30s ;
[0029] (2)92。〇~95。〇变性1〇8~3〇8,54。〇~64。〇退火1〇8~3〇8,72。〇1〇8~3〇8，共 进行35~45个循环；
[0030] (3) 72°C延伸 IOs ~30s。
[0031] 如上所述检测沙门氏菌及耐药基因整合子的方法，其特征在于步骤C中所述高分 辨率熔解曲线分析，按以下步骤进行：
[0032] (1)92°C ~96°C 变性 Imin ;
[0033] (2) 40 °C 复性 Imin ;
[0034] (3)然后初始熔解温度60°C~65°C，开始程序升温熔解至90°C~95°C，并在熔解 过程中实时检测荧光信号，15~25次/秒。
[0035] 如上所述检测沙门氏菌及耐药基因整合子的方法，其特征在于步骤A中所述提取 样品DNA的具体步骤如下：
[0036] 取L 5mL培养物1000 Orpm离心2min ;沉淀物加入500 μ L的TE缓冲液，反复吹 打使之重新悬浮，加入30 μ L 10% SDS和15 μ L的蛋白酶K，混匀，于37°C温育Ih ;加入 IOOyL 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65°C温育IOmin; 加入等体积的酷或氯仿或异戊醇混勾，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0. 8倍体 积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；沉淀用ImL的70 %乙醇洗涤后，加入TE溶液溶 解沉淀，即可。
[0037] 本发明中标准品模板的制备：
[0038] 以常规PCR方法扩增目的基因。PCR产物经1 %凝胶电泳分析，采用PCR产物回收 试剂盒对PCR产物进行回收，将纯化后的PCR产物与载体pMD18-T连接，将连接产物转化至 感受态细胞，筛选得到单菌落，挑选单菌落至含抗生素的液体培养基，过夜培养，提取质粒， 以提取的重组质粒DNA为模板进行PCR鉴定，并对重组质粒进行测序鉴定。提取验证正确 的阳性重组质粒，并测定其浓度，将其10倍倍比稀释。
[0039] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0040] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的阳性质粒模板DNA加 入前述反应体系，进行敏感性实验。结果各耐药基因检测灵敏度均低于〇. lpg，且具有很好 重复性。各耐药基因稀释模板浓度和Cp值之间呈良好的线性关系，R2均大于0. 95,说明该 方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
[0041] 本发明被检测样品可以是食物，本发明检测方法为非疾病诊断方法。
[0042] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0043] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于荧光PCR检 测沙门氏菌和int基因；
[0044] 2)本