一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记gga-miR-34a-5p及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子 标记gga-miR-34a-5p及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)为革兰氏阴性菌，是世界公认的食源性 致病菌之一，不仅对蛋鸡生产造成重大影响，而且它能通过家禽副产品给人类的健康带来 很大的威胁。这种病菌主要是通过动物性产品包括禽肉，鸡蛋和奶类及奶制品等导致人中 毒甚至死亡。因此如何获得抗性高的遗传个体成为亟待解决的问题之一。
[0003] 小RNA(miRNA)是一类长度约22nt的内源性非编码小RNA，与靶基因非翻译 区）结合在转录后水平调控靶基因的表达，在细胞增殖、分化、凋亡、神经发育、脂肪代谢等 多个生物学过程中发挥重要作用。
【发明内容】
[0004]本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种鸡 肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNAgga-miR-34a-5p，发明人经过研究发现，gga-miR-34a-5p可以通过调控N0TCH2基因的表达调控 肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-34a-5p可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分 子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。
[0005]发明人提供的具体技术方案如下：
[0006]发明人首先提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记，该抗性分子标 记为鸡miRNAgga-miR-34a-5p，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示；
[0007]发明人进一步给出了该分子标记的检测方法如下：
[0008] gga-miR-34a-5p的表达量检测
[0009]miRNA反转录
[0010] 用OneStepPTi.ffie.S:e.Tipt?.miRNAcDNASynthesisKit(PerfectRealTime)试 剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20yL(具体见表1)。反应程序为:37°C，60min; 85°C， 5s;反应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用；
[0011] 表1miRNA反转录体系(20μυ
[0012]
[0013 ]其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得，
[0014] gga-miR-34a_5p焚光定量PCR
[0015] 根据gga-miR-34a_5p成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合 成。利用所设引物，采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPrimeScriptTM miRNART-PCRKit说明书，在StratageneMX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如 表3所示。
[0016] 表2miRNA定量检测引物
[0017]
[0018]其中〉gga_34a_5p和U6分别作为ForwardqPCRPrimer，而Uni-miRqPCRPrimer 选用试剂盒中自带引物；
[0019] 荧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，l个循环;95°C5s，60°C30s，40 个循环；最后添加溶解曲线(95°Clmin，62°C30s，95°C30s)，1个循环，每个cDNA样品重复三 次。以U6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方 差分析对miRNA表达量差异进行分析。
[0020] 表3荧光定量PCR体系（20μυ
[0021]
[0022]发明人为了验证上述gga-miR-34a-5p的功能采用了革Ε1基因检测的方式，利用TargetScan及miRanda等软件预测到N0TCH2是gga-miR-34a-5p的革E基因。结果发现通过分 别比较肠炎沙门氏菌感染组与未感染组中miRNA与革E1基因的调控方向，可知gga-miR-34a-5p在感染组中显著下调，靶基因N0TCH2在感染组中的表达量显著高于未感染组（如图1所 示），即gga-miR-34a-5p与N0TCH2调控方向相反，表现出相互作用关系，与生物信息学预测 结果一致。说明gga-miR-34a-5p可以通过调控N0TCH2基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的 感染。因此gga-miR-34a-5p可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记。
[0023]综上所述，本发明提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记及其检测方法， 该抗性分子标记为鸡miRNA gga-miR-34a-5p，发明人经过研究发现，gga-miR-34a-5p可以 通过调控N0TCH2基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-34a-5p可以作为 肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗 病遗传育种奠定基础。
【附图说明】
[0024] 图1为RNAgga-miR-34a-5p与靶基因N0TCH2在感染组相对未感染组中的表达差异 倍数柱状图，
[0025] 由图可知，gga-miR-34a-5p在感染组中显著下调，N0TCH2在感染组中的表达量显 著高于未感染组，即gga-miR-34a-5p与N0TCH2调控方向相反，表现出相互作用关系，说明gga-miR-34a-5p可以通过调控N0TCH2基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染。
【具体实施方式】
[0026]下述实施例中除特殊说明之外，所采用的均为本领域现有技术；
[0027]实施例1
[0028]gga-miR-34a_5p的表达量检测
[0029]miRNA反转录
[0030] 用OneStepPrinieScript?miRNAcDNASynthesisKit(PerfectRealTime)试 剂盒，严格按说明书进行。反转录体系为20yL(表1)。反应程序为:37°C，60min; 85°C，5s;反 应完成后获得的cDNA置于-20°C保存备用；
[0031] 表1miRNA反转录体系（20yL)
[0034]其中所述的盲肠总RNA为鸡盲肠总RNA，采用常规方法获得，
[0035]gga-miR-34a_5p焚光定量PCR
[0036]根据gga-miR-34a_5p成熟序列设计引物(表2)，由上海生工生物工程有限公司合 成。利用所设引物，采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPrimeScriptTM miRNART-PCRKit说明书，在StratageneMX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如 表3所示。
[0037] 表2 miRNA定量检测引物
[0038]
[0039]其中〉gga_34a_5p和U6分别作为ForwardqPCRPrimer，而Uni-miRqPCRPrimer 选用试剂盒中自带引物；
[0040] 荧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40 个循环；最后添加溶解曲线(95°Clmin，62°C30s，95°C30s)，1个循环，每个cDNA样品重复三 次。以U6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方 差分析对miRNA表达量差异进行分析。
[0041 ] 表3荧光定量PCR体系（20μυ
[0042]
[0043] 实施例2
[0044] 靶基因N0TCH2的表达量检测
[0045] mRNA反转录
[0046] 根据试剂盒说明书要求，利用TaKaRaPrimerScriptTMRTreagentkit (PerfectRealTime)试剂盒将mRNA反转录为cDNA，放在-20°C保存备用。反转录体系如表4 所示。反转录步骤:37°C，15min;85°C，5s。
[0047] 表4反转录体系
[0048]
[0049] N0TCH2 荧光定量PCR
[0050] 根据NCBI数据库mRNA序列（登录号:XM_001233595)，用PrimerPremier5.0设计荧 光定量PCR引物(表5所示），引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0051 ] 表5引物序列
[0053] 采用SYBRGreenI染料法，按照TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqTM说明书，在 StratageneMX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系为20yL(表6):SYBRPrimerEx TaqTM(2X)10μ1,ForwardPrimer(10μΜ)0.4μ1,ReversePrimer(10μΜ)0.4μ1,ROX ReferenceDyeΠ(50X)0 · 4yL，cDNA模板2yL，灭菌双蒸水（ddH2〇)6·8yL，终体积20yL。反应 程序为两步法:95°C预变性30s，PCR反应为:95°C，5s; 60°C，30s;循环40次;添加溶解曲线： 95°C，lmin; 61°C，30s; 95°C，30s;每个样品重复3次。以β-actin作为内参，用2-AAGt方法来 计算mRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方差分析对mRNA表达量差异进行分析。 [0054]表6荧光定量PCR体系
[0055]
[0056] 实施例3
[0057]鸡接种肠炎沙门氏菌试验
[0058]将沙门氏菌阴性白来航蛋鸡分为感染组与未感染组，感染组每只鸡接种5.8X l〇8CFU肠炎沙门氏菌，未感染组接种磷酸盐缓冲液(PBS)，接种后第7天采集盲肠组织样品。 按照使用说明，用Trizol法提取盲肠总RNA。
[0059]gga-miR-34a-5p与肠炎沙门氏菌感染的相关性分析
[0000] 利用实施例1所述方法，检测肠炎沙门氏菌感染后盲肠组织gga-miR-34a_5p表达 变化。定量结果显示，gga-miR-34a-5p在感染组盲肠中的表达量显著低于未感染组(Fold change= -2.79)。说明gga-miR-34a-5p与肠炎沙门氏菌感染具有较强的相关性。
[0061 ]N0TCH2与肠炎沙门氏菌感染的相关性分析
[0062] 利用实施例2所述方法，检测盲肠N0TCH2表达与肠炎沙门氏菌感染的相关性。结果 显示，感染组N0TCH2的表达量显著高于未感染组，是未感染组的1.29倍（P〈0.05)。说明 N0TCH2与鸡肠炎沙门氏菌感染相关。
[0063]gga-miR-34a-5p与其靶基因N0TCH2的互作分析
[0064] 通过分别比较感染组与未感染组中miRNA与革E1基因的调控方向，可知gga-miR-34a-5p在感染组中显著下调，N0TCH2在感染组中的表达量显著高于未感染组（如图1)，即gga-miR-34a-5p与N0TCH2调控方向相反，表现出相互作用关系。说明gga-miR-34a-5p可以 通过调控N0TCH2基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染。因此gga-miR-34a-5p可以作为 肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记。
【主权项】
1. 一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记，该分子标记为鸡miRNA gga-miR-34a-5p，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。2. 权利要求1所述鸡肠炎沙门氏菌感染抗性性状的分子标记gga-miR-34a-5p检测方 法，具体步骤如下： gga-miR-34a-5p的表达量检测 miRNA反转录 用One StepPrimeScriptAmiRNA cDNA Synthes is Kit试剂盒，严格按说明书进行；反 转录体系为20yL，如表1所示;反应程序为:37°C，60min; 85°C，5s;反应完成后获得的cDNA置 于-20°C保存备用； 表1 miRNA反转录体系(20yL) gga-miR-34a_5p 焚光定量 PCR根据gga-miR-34a-5p成熟序列设计引物，如表2所示；利用所设引物，采用SYBR Green I染料法，按照TaKaRa公司的SYBR PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit说明书，在 Stratagene MX3000P荧光定量PCR仪上进行扩增，反应体系如表3所示； 弄2 miRNA宙量拾涮引物表3荧光定量PCR体系荧光定量PCR反应程序采用两步法:95°C预变性30s，1个循环;95°C5s，60°C30s，40个循 环;最后添加溶解曲线(95°Clmin，62°C30s，95°C30s)，一个循环，每个cDNA样品重复三次； 以U6作为内参基因，用方法来计算miRNA的相对表达量，用SAS8.1软件中单因素方差 分析对gga-miR-34a-5p表达量差异进行分析。
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染抗性分子标记及其检测方法，该抗性分子标记为鸡miRNA？gga-miR-34a-5p，发明人经过研究发现，gga-miR-34a-5p可以通过调控NOTCH2基因的表达调控肠炎沙门氏菌对鸡的感染，因此gga-miR-34a-5p可以作为肠炎沙门氏菌感染抗性检测的分子标记，发明人进一步提供了其检测方法，从而为鸡的抗病遗传育种奠定基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/113
【公开号】CN105463109
【申请号】CN201610015489
【发明人】李显耀, 吴桂贤, 刘丽英, 刘肖意
【申请人】山东农业大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年1月11日