专利名称：肠炎沙门氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品检测技术领域，具体涉及肠炎沙门氏菌核酸标准样品制备、其建立方法及其在检测肠炎沙门氏菌中的应用。
背景技术：
食品安全是重大公共卫生问题，是制约我国经济发展的重要因素。而微生物污染造成的食源性疾病，是我国食品安全中最突出的问题。近年来，随着食品产业结构的调整、经济全球化与国际贸易的迅速发展，我国食源性疾病的防控面临一系列新问题和挑战。食品中微生物引起食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注，食品中微生物的检测技术是预防与控制的关健的技术环节。目前我国食品中微生物的检测仍以传统的 病原菌培养、血清抗体检测、和生化特征比较水平为主，不能满足日益发展的检验检疫工作的需要。常规分离培养耗时长，灵敏度低，某些微生物的培养极为困难。随着2007年《食品中致病菌检测方法——实时PCR法》(SN/T1870-2007)和《食品中多种致病菌快速检测方法一PCR法》(SN/T1869-2007)两项检验检疫行业标准的发布实施，以及即将发布实施的《食品中致病菌检测方法一DHPLC法》等系列分子生物学检测国家标准和行业标准。简单快速，灵敏度高的PCR、实时荧光PCR技术，正在食品致病菌检测领域开始发挥重要作用。由于食品中细菌的特殊性，人们很难获得细菌分子生物学检测阳性样品，加之食品中致病菌分子生物学检测技术的研究刚刚起步，而配套的标准样品的研究工作则起步较晚，制备技术复杂，样品定值和不确定度的评估存在很多困难，因而国内外食品致病菌核酸标准样品(定量、定性测试)基本上是一片空白。目前国内外没有适用于食品中致病菌分子生物学检测用核酸标准样品，仅有成套分子生物学检测试剂盒中配备的阳性对照品，价格非常昂贵，也不具备核酸标准样品的效能，不能适时地满足检验检疫工作的需要。研究制备新型的食品致病菌核酸标准样品，对于保证灵敏、特异、快速检测食品中致病菌，具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决食品中致病菌核酸标准样品目前国内外均处于空白状况，本发明主要针对食品中致病菌肠炎沙门氏菌核酸定性和定量检测项目，研究制备食品中肠炎沙门氏菌核酸标准样品。通过对致病菌核酸标准样品的关键制备技术和保存技术的研究，并进行定值技术和定值方式的研究，开展均匀性和稳定性研究，并对食品中致病菌核酸标准样品值的不确定度进行深入细致的研究，最终研制出具有较好的均匀性和稳定性的肠炎沙门氏菌核酸标准样品。开发处于世界领先水平，具有我国自主知识产权的食品中致病菌核酸标准样品制备技术；满足食品安全检测的需求，满足国内外食品微生物检测实验室的需求。本发明所采用的技术方案是肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis) ATCC 13076的菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作。取制备的核酸标准样品，经采用实时PCR方法和PCR方法定性分析,确认所制备的核酸标准样品为肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis) ATCC :13076核酸样品。采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法及紫外分光光度法，随机抽取样品进行测试，数据进行T检验和F检验确认样品均匀性。经Grubbs检验和Cochran检验，所有数据均可作为定值依据；经正态性检验，这些数据符合正态分布。制备的核酸样品经过了四年的稳定性测定，在避光、密封，-20°C以下温度贮存，四年内稳定。本发明的一方面在于一种肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)的标准样品，其制备方法的步骤如下(一)基因组核酸的提取①肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis) ATCC :13076经菌株活化、增菌培养；②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4°C离心15min ；③吸弃上清，取沉淀I 3mL，加pH8. O的TE溶液IOmL悬浮，加O. 5mL浓度为IOOg/L SDS和50 μ L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ；④加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加I. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65°C温浴20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ；⑤取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ；其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 I ；⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ;其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿异戊醇的体积比为24 I ；⑦取上清，加上清O. 6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ；⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL pH8. O的TE溶液溶解，获得肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC :13076 基因组核酸溶液;⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当OD26tl/OD280比值在I. 7 I. 9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥；其中，上文所述ρΗ8· O的TE缓冲液组成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 ρΗ8· O 的 TE 缓冲液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. O 和 Iml
0.5MEDTA PH=8. O的溶液于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400ml蒸馏水均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。(二)·冷冻干燥①样品预冻先把步骤I所得的核酸样品溶液在_80°C低温冷冻2h ；②冷冻过程干燥室制冷，温度降至_35°C时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度 降至-40°C时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0. 5Torr时，结束冷冻过程；③样品干燥干燥室温度设置为15°C，当真空度降至0. ITorr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC :13076基因组核酸标准样品，置于_20°C中避光贮存。肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸标准样品的制备,可广泛应用于多种食品的检测试剂盒内，作为阳性标准对照品。本发明的另一方面在于提供一种肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)的检测试剂盒(不是应用于疾病诊断目的)，包括肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)检测基因和阳性标准对照品，I.肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)检测基因，至少包括下述a或b中的一种a:肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特异片段invA基因PCR引物正向引物SEQID NO :I 51 -gtgaaattat cgccacgttc gggcaa-31反向引物SEQID NO 2 5' -tcatcgcacc gtcaaagaac c~3'b:肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特异片段的 Real-Time PCR 引物和探针序列
正向引物SEQID NO:3 5' -gcggcgttgg agagtgata-31反向引物SEQID NO 4 5' -agcaatggaa aaagcaggat g-3'探针SEQID NO :5 5' -FAM-catttcttaa acggcggtgt ctttccct-TAMRA-3'II .所述的阳性标准对照品是通过上述步骤(一)、(二)制备方法获得的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)标准样品。本发明中，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。利用肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)标准样品作为检测试剂盒中的阳性对照，制备而成的试剂盒，其使用方法为是以待测样品的基因组为模板，利用肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)检测基因，经过PCR或Real-Time PCR等反应,结束后，即可以直接以阳性对照为标准，根据琼脂糖凝胶电泳图或者荧光信号，以确定待测样品中是否含有肠炎沙门氏菌，也可以通过先制作标准曲线，再利用实施例中所提及的公式，以计算待测样品中转基因成分的含量。具体制作和检测方法参照实施例I和2。试剂盒以及阳性对照样品的使用方法可以灵活多变，本领域技术人员可以依据实验室的操作条件以及制定不同的实验方案，以实现不同的检测目的。本发明的创新特征是本发明解决了国内食品中致病菌核酸标准样品紧缺的状况，对解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义，并对开展食品中致病菌分子生物学检测工作，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。
图I.肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸标准样品制备工艺流程；图2. PicoGreen染料进行荧光定量的荧光标准曲线。PicoGreen染料进行荧光定量的荧光标准曲线，用PicoGreen染料进行荧光定量根据Quant-iTTM PicoGreen dsDNAReagent and Kits说明进行。用λ DNA梯度稀释样品加入同一板中作标准曲线。横坐标为梯度稀释的λ DNA浓度(ng/ μ L)，纵坐标为485nm激发光和535nm发射光的荧光强度。标准曲线显示了 PicoGreen方法的线性范围。在DNA浓度为O 1000ng/mL的浓度范围内，存在DNA浓度与荧光信号的线性关系。
图3，PicoGreen染料进行荧光定量的荧光标准曲线，用PicoGreen染料进行荧光定量根据 Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits 说明进行。用 λ DNA 梯度稀释样品加入同一板中作标准曲线。横坐标为梯度稀释的λ DNA浓度(ng/ μ L),纵坐标为485nm激发光和535nm发射光的突光强度。标准曲线显不了 PicoGreen方法的线性范围。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。DNA提取、和PCR反应试剂等基因工程实验中所用试剂均购于宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒购于宝生物工程(大连)有限公司(货号D9093)；TaqMan Universal Master Mix :购于 ABI 公司；引物和探针宝生物工程(大连)有限公司合成；实时荧光定量PCR仪ABI 7500型；实施例I菌株来源制备肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸标准样品所用标准菌株购自于美国标准菌种收藏所(American Type Culture Collection),肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)标准菌株号 ATCC : 13076。图 I 为肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)核酸标准样品制备工艺流程图。本文中，涉及基因工程操作方面的实验步骤、实验试剂配制等方法，如无特殊说明，均参考文献《分子克隆实验指南》。基因组核酸的提取方法按照GB/T4789.4-2008[1]进行菌株活化、增菌培养。提取增菌肉汤的DNA，采用 Qiagen 公司的 DNA 提取试剂盒(Qiagen Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit,货号13362)，并按其操作说明提取基因组DNA。制备核酸标准样品。(I)取细菌增菌培养液IOOmL,加到500mL无菌离心管中，4000g,4°C离心15min ；(2)吸弃上清，取沉淀lmL，加TE溶液(pH8. O) 10mL，悬浮，加O. 5mL 100g/L十二烧基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)和 50 μ L 蛋白酶 K (20mg/mL),混勻，37°C温浴Ih ；(3)加 2mL NaCl (5mol/L)，混匀，加 I. 5mL CTAB-NaCl 混合溶液(100g/L CTAB 和
O.7mol/L NaCl)，混匀，65°C温浴 20min ；(4)取上清，加等体积酚-氯仿-异戊醇混合液，(混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 1)，混匀，6000g离心IOmin ;(5)取上清，加等体积氯仿-异戊醇混合液(混合液中氯仿异戊醇的体积比为24 1)，混匀，6000g 离心 IOmin ;(6)取上清，加O. 6倍体积异丙醇，轻轻混匀，13000g离心IOmin ；(7)取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL TE溶液(pH8. O)溶解，此即为细菌基因组核酸溶液。其中，上文所述ρΗ8· O的TE缓冲液组成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 ρΗ8· O 的 TE 缓冲液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. O 和 ImlO. 5MEDTA PH=8. O的溶液于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400ml蒸馏水均匀混合；将溶液
定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。基因组DNA的质量检查[2](I)直接法——DNA完整性确认用提取的DNA直接电泳检查，1%琼脂糖凝胶电泳，如图 2,M 为 λ -HindIII digest DNA Marker (Takara D3403A), I 为提取的肠炎沙门氏菌基因组DNA。检查结果表明电泳条带清晰明亮，条带单一，无杂带，无RNA，说明提取的DNA质 量很好，核酸具有完整性和高分子量。(2)紫外分光光度计法用紫外分光光度计来检测提取DNA的0D23(I、OD260, OD280光吸收值。取5 μ L DNA溶液加ddH20梯度稀释至lmL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。当0D26Q/0D28Q比值在I. 7 I. 9之间时，适宜于PCR扩增。
测试结果表明OD23tlAD26tl值小于O. 7，0D26(i/0D28(i值为I. 9，结果表明所提取的核酸标准样品DNA质量很好。肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸标准样品的冷冻干燥及分装冷冻干燥程序(I)样品预冻先把核酸样品溶液在_80°C低温冷冻2h。(2)冷冻过程关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至_35°C时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至_40°C时，将预冻的标准样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空，真空表显示值开始下降；待真空度降至
O.5Torr时，结束冷冻过程。(3)样品干燥对干燥室加热，提高样品干燥速度；干燥室的温度设置为15°C。当真空度降至O. ITorr或更低时,表示样品已干燥好。(4)关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。核酸样品按以上冷冻干燥程序制成冻干粉，即肠炎沙门氏菌(SalmonelIaEnteritidis)核酸标准样品；分装将获得的核酸标准样品分装于内置微量管的样品套管中，分装400管，冷冻干燥；每管肠炎沙门氏菌核酸标准样品含量为5 μ g。分装后的样品加贴唯一性标识，放置于-20°C中避光贮存。实施例2一定性检定IPCR 分析a.仪器PE2400，美国PE公司b.测定取制备的核酸标准样品，经PCR分析测定
肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特异片段invA基因PCR引物正向引物SEQID NO :I 51 -gtgaaattat cgccacgttc gggcaa-31反向引物SEQID NO 2 5' -tcatcgcacc gtcaaagaac c~3'反应条件预变性94°C,3min ；进入循环94°C变性60s，60°C退火60s，72°C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min; 扩增产物长度为284bp,扩增出肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)特异性基因片段，测序后结果证实为肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)。2实时荧光PCR分析a.仪器ABI 7500型实时荧光定量PCR分析仪b.测定取制备的核酸标准样品,应用肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)特异性引物和探针，经实时荧光定量PCR分析测定，结果证实为肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)。肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特异片段的Real-Time PCR引物和探针序列正向引物SEQID NO 3 5' -gcggcgttgg agagtgata-31反向引物SEQID NO 4 5' -agcaatggaa aaagcaggat g-3'探针SEQID NO :5 5' -FAM-catttcttaa acggcggtgt ctttccct-TAMRA-3'其中FAM 为 6-carboxyfluorescein, TAMRA 为6-carboxytetramethylrhodamine ；PCR所用试剂购于宝生物，使用宝生物Premix Ex Taq试剂盒，货号DRR039S。FAM (羧基荧光素)吸收波长492nm，发射波长518nm。反应条件37°C，5min ;95°C预变性3min ;95°C变性5s;60°C退火延伸40s，同时收
集FAM荧光，进行40个循环。4°C保存反应产物。经ABI 7500型实时荧光定量PCR分析仪检测阴性对照检测结果显示，FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常。根据以上PCR和实时荧光PCR分析的结果，可得出如下结论定性分析结果表明所制备获得的DNA核酸标准样品为肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸标准样品。二定值方法采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法[3 5]测定肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)核酸标准样品，进行标准样品定值。I.试剂、耗材、主要仪器Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits invitrogen 公司，包括Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent、20 X TE、λ DNA 标准样品；黑色平底96孔板Greiner公司。多功能酶标仪TECANGENios PLUS
2. DNA标准曲线绘制(a) DNA标准样品稀释、检测①100ug/mL的λ DNA标准样品，用TE稀释成2ug/mL DNA贮存液。②2ug/mL的λ DNA标准样品贮存液按表I进行稀释。③每个反应孔按表I所示，再加入ImL Quant-iTTM PicoGreen试剂,混勻,在室温避光孵育2-5min。④多功能酶标仪检测。表I DNA标准曲线配制
权利要求
1. 一种肠炎沙门氏菌标准样品，其特征在于通过以下方法制备 1.基因组核酸的提取 ①肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis) ATCC :13076，经菌株活化、增菌培养； ②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4°C离心15min； ③吸弃上清，取沉淀I 3mL，加pH8.O的TE溶液IOmL悬浮，加O. 5mL浓度为100g/L SDS和50 μ L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ； ④加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加I. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65°C温浴20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 O. 7mol/L NaCl ； ⑤取上清，加与上清等体积的酹-氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心IOmin;其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 I ； ⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心IOmin;其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿异戊醇的体积比为24 : I ; ⑦取上清，加上清O.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ； ⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8. O的TE溶液溶解，获得肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC :13076 基因组核酸溶液; ⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当0D26(l/0D28(l比值在I. 7 I. 9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥； II .冷冻干燥 ①样品预冻先把步骤I所得的核酸样品在-80°c低温冷冻2h； ②冷冻过程干燥室制冷，温度降至-35°C时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40°C时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0. 5Torr时，结束冷冻过程； ③样品干燥干燥室温度设置为15°C，当真空度降至0.ITorr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC :13076基因组核酸标准样品，置于_20°C中避光贮存。
2.—种非应用于疾病诊断目的的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)的检测试剂盒，其特征在于，包括肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)检测基因和阳性标准对照品， I.肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)检测基因，至少包括下述a或b中的一种 a:肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特异片段invA基因PCR引物 正向引物SEQ ID NO 1 反向引物SEQ ID NO 2 b:肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特异片段的Real-Time PCR引物和探针序列 正向引物SEQ ID NO 3 反向引物SEQ ID NO 4 探针SEQ ID NO 5 II.所述的阳性标准对照品是权利要求I所述的肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)标准样品。
全文摘要
本发明公开一种肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸标准样品、其建立方法及应用，其通过菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作,获得一种肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)核酸标准样品。本发明解决了国内食品中致病菌核酸标准样品紧缺的状况，对解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义，并对开展食品中致病菌分子生物学检测工作，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。
文档编号C12Q1/68GK102719424SQ20121017220
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者于兵, 徐君怡, 徐杨, 曹际娟 申请人:于兵, 徐君怡, 徐杨, 曹际娟