用于治疗和/或预防癌症的沙门氏菌菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型（Salmonellaentericaserovar typhi)菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力 (non-viable)的减毒非重组突变体的药物组合物，其用于治疗和/或预防癌症。优选地，所 述癌症为膀胱癌。
【背景技术】
[0002] 在欧洲和美国，膀胱癌是男性中排第四位的最常见的癌症病因。3/4的肿瘤被诊断 为非肌层浸润性膀胱癌（匪IBC)并局限于膀胱粘膜中。根据具体的肿瘤阶段和级别特征， 使用卡介苗（BCG)的膀胱内（ives)免疫疗法部分地限制了这些肿瘤在经尿道内窥镜切除 手术后复发和可能发展的高的倾向。BCG减少膀胱癌的复发和发展。但是，在接近90 %的 患者中出现与BCG细菌感染膀胱组织并可能扩散的能力或所诱导的强炎症相关的副作用， 范围从膀胱炎到败血症和死亡。
[0003] BCG的精确作用机理仍然未知。但是，已证明在膀胱内滴注后BCG感染尿道 上皮细胞和癌细胞并被其内化，引起导致抗肿瘤应答的炎性细胞和细胞因子的大量涌 入（综述参见Askeland,Newton, 0'Donnell, &Luo, 2012)。在临床试验或动物模型中 对一些策略进行了测试，所述策略例如将细胞因子与BCG结合，降低BCG的剂量，使用 分枝杆菌细胞壁替代BCG，或使用toll样受体（TLR)激动剂刺激免疫系统（综述参见 Kresowik&Griffith，2009)，但是迄今为止BCG仍是减少NMIBC复发/发展的最佳选择。 两项使用ivesTLR激动剂的研究已在MB49原位膀胱癌模型中证明了治疗潜力，第一项 研究证明CpG--- 种TLR9 激动剂--优于BCG疗法（Mangsbo,Nanalga,Essand,Lo skog, &Totterman, 2008)，第二项研究证明在该模型中R-837具有抗肿瘤作用（Hayashi etal.，2010)。类似地，Seow等人最近也已报道了ives乳杆菌的抗肿瘤作用（Seowet al. , 2010) 〇
[0004] 已进行了大量尝试，以开发包含减毒重组细菌和/或减毒肿瘤靶向细菌（特别 是减毒的伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi))的组合物，用于抑制实体瘤癌症的生长或 减小其体积，例如W003/063593(VionPharmaceuticals)、US2007/0298012 (I.King&L. -M. Zheng)、W02009/098246(AeternaZentarisGmbH)、W02006/076678 (Univ.JohnHopkins)， 但是这些尝试都未能在人类临床试验中获得可持续的功效（Chorobik,Czaplicki,Ossysek ,&Bereta, 2013)〇
[0005] 基于这些原因，仍需要提供比BCG更安全、更有效的组合物以治疗癌症，特别是膀 胱癌。
【发明内容】
[0006] 本发明涉及包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/ 或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物，其用于治 疗和/或预防膀胱癌。
[0007] 本发明还提供了用于诱导癌细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括给予包含肠 道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变 型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物。
[0008] 另一目的涉及治疗和/或预防膀胱癌的方法，所述方法包括给予包含肠道沙门 氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株 的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物，其中所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的 活的或无活力的减毒非重组突变体不在肿瘤中存留，并且选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD 909、Ty800、M01ZH09、x9633、x9639、x9640 和x8444。
[0009] 本发明的其他目的是提供诱导癌细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括给予包 含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血 清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体的药物组合物。
[0010] 还提供了肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道 沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非重组突变体用于制备用于治疗和/或预防 膀胱癌的药物的用途，其特征在于所述肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的或无活力 的减毒非重组突变体不在肿瘤中存留，并且选自Ty21a、CVD908-htrA、CVD909、Ty800、 M01ZH09、x9633、x9639、x9640和x8444。
【附图说明】
[0011] 图1 :BCG或Ty21a处理时原位膀胱肿瘤消退的比较。在22%的EtOH预处理之后， 用200' 000个MB49-luc细胞对10-20只雌性C57BL/6小鼠组进行ives滴注（第0天）。 使用能够检测生物发光的体内成像系统Xenogen监测肿瘤生长，在第8天荷瘤小鼠的代表 性结果如（A)所示。在第1、8、15和22天，使用不同剂量的BCG或Ty21a对小鼠组进行ives 处理，同时一组小鼠保持未处理。所述处理的范围从Ty21a初始胶囊或BCG小瓶的1/10 (B)， 至IJ1/100和1/1000 (C)。示出了每一组的随时间的小鼠存活百分数。经校正的对数秩检验之 后的显著性差异表示为：在B中*ρ〈0·025或*〈0·0125,#ρ〈0·0025,在C中*#ρ〈0·00025。
[0012] 图2 :Ty21a或BCG处理后细菌从膀胱的回收。在第0天使用Ty21a对7组小鼠 (每组4只）进行ives激发（平均值土SEM1. 3X10s±4. 3X107CFU/小鼠）（A)。在第-1 天使用200' 000个MB49-luc细胞对6组小鼠进行ives激发，并在24h之后，在第0天用 Ty21a处理（平均值土SEM3· 9X10s±2. 4X10SCFU/ 小鼠）（B)或用BCG(2-8X107CFU/ 小 鼠）（C)处理。在感染后的不同时间点处死小鼠。处理膀胱并将其置于盘中，如材料和方法 中所述。数据被表示为CFU数/组织。水平线代表平均应答。
[0013] 图3 :单剂量Ty21a之后健康膀胱中的先天和适应性免疫应答的特征。在第0天使 用Ty21a(平均值土SEM1. 3X10s±4. 3X107CFU/小鼠）对小鼠组（每组5只）进行ives 激发，并在处理后的不同时间点处死小鼠。增加一组4只首次用于实验的小鼠（nalive mouse)。回收膀胱细胞，进行流式细胞术染色。使用aquadead试剂盒排除死细胞。示出 了先天免疫细胞（A):嗜中性粒细胞、NK、巨噬细胞和DC's，以及适应性免疫细胞（B) :CD4 和⑶8T细胞的百分数。水平线代表平均百分数。在单因素Anova、Dunnet多重比较检验 之后表示出不同时间点和首次用于实验的小鼠之间的显著性差异，*p〈〇.05。
[0014] 图4 :单剂量Ty21a之后健康膀胱中的先天和适应性免疫应答的特征。在第0天 使用200' 000个MB49-luc细胞对小鼠组（每组4至10只）进行ives激发，并在第1、8、 15和22天用PBS或1/10的BCG或Ty21a处理。在不同的时间点--每次处理后24h或7 天以后处死小鼠。处理并回收膀胱癌细胞，进行流式细胞术染色。使用aquadead试剂盒 排除死细胞。在每个时间点的先天免疫细胞（A):嗜中性粒细胞、NK、巨噬细胞和DC's，以 及适应性免疫细胞（B) :CD4和CD8T细胞的百分数代表整体的一部分。在每个饼形图的下 方表示出所有细胞群的百分数的总和。在单因素Anova、Dunnet多重比较检验之后表示出 显著性差异，*P〈〇. 05。
[0015] 图5 :MB49凋亡和坏死细胞群的百分数。使用不同Μ0Ι的Ty21a感染MB49细胞系， 24h或72h之后回收细胞，进行AnnexinV和7AAD染色并通过流式细胞术进行分析。代表 性的图如（A)所示。数据代表每个细胞群的百分数：早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细 胞；每次处理重复三次，由平均值和SEM表示（B)。在双因素Anova之后，处理和对照细胞 之间的显著性差异是由***P〈〇. 001或****P〈〇. 0001表示。
[0016] 图6 :MB49细胞分泌的炎性细胞因子的浓度。使用不同Μ0Ι的Ty21a感染MB49细 胞系，24h后使用鼠炎症试剂盒分析细胞上清液的炎性细胞因子，以检测和定量IL-12p70、 TNF、IFN-γ、MCP-1、IL-10和IL-6细胞因子。检测到两种细胞因子：MCP-1和IL-6。每 个柱对应于相应处理的细胞因子浓度；每次处理重复三次，由平均值和SEM表示。在单因 素Anova、Dunnet多重比较检验之后，每次处理和对照（Μ0Ι0)之间的显著性差异是由 *ρ〈0· 05、***ρ〈0· 001 和 ****ρ〈0· 0001 表示。
[0017] 图7 :人尿道上皮细胞系分泌的炎性细胞因子的浓度。使用不同Μ0Ι的Ty21a感 染两种人尿道上皮细胞系RT4 (A)和RT112 (B)，24h后使用炎症试剂盒分析细胞上清液的炎 性细胞因子分泌，以检测和定量IL_12p70、TNF、IFN-γ、MCP-1、IL-10和IL-6细胞因子， 或使用人炎症试剂盒进行分析以检测和定量IL_12p70、TNF、IL-10、IL-6、IL-1β和IL-8。 每个柱对应于相应处理的细胞因子浓度；每次处理重复三次，由平均值和SEM表示。在单 因素Anova、Dunnet多重比较检验之后，每次处理和对照（Μ0Ι0)之间的显著性差异是由 *ρ〈0· 05、***ρ〈0· 001 和 ****ρ〈0· 0001 表示。
【具体实施方式】
[0018] 尽管与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可用于实施或测试本发 明，但适合的方法和材料如下所述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文 献均以引用的方式全文纳入本文。提供本文所讨论的出版物和申请，仅因为它们的公开先 于本申请的申请日。本文不应被解释为承认本发明由于在先发明而没有资格早于这些出版 物。此外，所述材料、方法和实施例只是举例说明性的，而不意欲进行限制。
[0019] 除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明主题所属技 术领域的技术人员通常所理解的含义相同。提供本文使用的以下定义，以促进对本发明的 理解。
[0020] 术语"包含（comprise) " 或"包括（comprising) " 通常用作"包括（include/ including) "的意义，即允许存在一个或多个特征或组分。此外，术语"包括"也包含术语 "由……组成"。
[0021] 除非上下文中另有明确说明，说明书和权利要求书中使用的单数形式"一"、"一 个"和"所述"包括复数指代对象。
[0022] 本文使用的"至少一个"意指"一个或多个"。
[0023] 出乎意料地，本发明的申请人已证明包含肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的活的 (有活力的）减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒非 重组突变体的药物组合物可用于治疗和/或预防癌症。
[0024] 所述癌症可选自非限制性癌症组，其包括黑色素瘤、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列 腺癌、肺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑脊膜 瘤、腺癌、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺 癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌（hepatocellularcancer)、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、 胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌（livercancer)、肝细胞瘤（hepatoma)、直肠癌、结直 肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌（hepaticcarcinoma)、 肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈癌。
[0025] 优选地，所述癌症为膀胱癌，最优选地为非肌层浸润性膀胱癌。
[0026] 在膀胱癌的情况下，本发明的药物组合物优选地被局部给予到膀胱，最优选地通 过滴注（例如通过膀胱内滴注（ives))。
[0027] 可所述药物组合物局部给予到膀胱数次。初始给药（首次给药）之后，可每1周、 2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17 周、18周、19周、20周、21周、22周、23周或24周再给予本发明的药物组合物，但是优选每 1-2周再给予。例如，可每1周对患者进行治疗，使其接受最多6次滴注，取决于药物组合物 和待治疗的癌症。
[0028] 根据待治疗的癌症，其他给药途径也可以是适合的。所述药物组合物的给药形式 可以是全身或局部的。例如，本发明的药物组合物可通过任何方便的途径给予，包括口服、 含服（buccal)、舌下、胃肠外、经皮、阴道、直肠等。
[0029] 通常，使用本发明的药物组合物进行的治疗在于减少或限制癌症（例如膀胱癌） 的复发和/或发展。
[0030] 本文使用的"减毒