的方法，所述炎性细胞因子可参 与人体中的抗肿瘤免疫应答和肿瘤消退，所述方法包括给予包含肠道沙门氏菌伤寒血清变 型菌株的活的减毒非重组突变体和/或肠道沙门氏菌伤寒血清变型菌株的无活力的减毒 非重组突变体的药物组合物。
[0054] 可选地或额外地，还显而易见的是，本发明的药物组合物可单独给予或者与其他 治疗、疗法或试剂组合给予（同时或惯序），取决于待治疗的病症。例如，其他治疗、疗法或 试剂可适用于治疗癌症如膀胱癌。
[0055] 参考以下实施例，将会更充分地理解前述说明。
[0056] 实施例
[0057] 实施例1:材料和方法
[0058] 小鼠和细胞培养
[0059] 按照瑞士兽医局的伦理准则，使用8至10周龄的雌性C57BL/6WT小鼠（Charles River,L'Arbresle,France)。MB49细胞系（由瑞典乌普萨拉大学A.Loskog教授惠赠）是 来自C57B1/6雄性小鼠的致癌物诱导的移行细胞癌（Summerhayes&Franks，1979)。人尿道 上皮细胞系RT4(Rigby&Franks, 1970)和RT112(Mastersetal.，1986)是由瑞士伯恩的 Thalmann教授惠赠。将所有的细胞系维持在DMEM培养基（杜尔贝科氏改良伊格尔培养基） 中，所述培养基补充有1〇%胎牛血清$85)、1001]/1111青霉素和链霉素，以及!1印^(1〇1111) (全部来自于瑞士Invitrogen,Lifetechnologies,Zug)。使用Lenti-luc感染MB49 细 胞以产生MB49_luc细胞，如Decrausazetal.，2011中所述。使用FluostarOmega光度 计（13]\^1^1^6(3]1，0€€6111311找，661'1]1&115〇，在添加〇-焚光素（终浓度为0.1511^/1111，？1'〇1116区&， DUbendorf，瑞士）之后测量焚光素酶表达。
[0060]BCG和Ty2la在麻醉的小鼠中使用Introcan24G/3/4(Braun,Melsungen,德国） 通过导管插入术ives滴注BCG(:011C〇T丨CE?,EssexChemieSA,Luzern,瑞士）或 Ty21a(Vivoiif?,Crucell,Bern,瑞士）（如下文所述）。在85°C水浴孵育30分钟之后 获得热灭活的细菌，然后涂板以确认灭活。通过在LB琼脂（BDDifco,Basel,瑞士）平板 (对于Ty21a)或在富含 0ADC(BD，Basel，瑞士）的M7Hll(Remel，Kansas，USA)平板（对 于BCG)上涂布确认所滴注的每种细菌的剂量，以及细菌灭活的确定。Ty21a胶囊包含至少 2X109个有活力的细菌和5-50X10 9个死细菌。每个BCG小瓶包含2-8X10 8个细菌。在封 闭的容器中将LB琼脂平板在37°C下孵育48h，将M7H11平板在37°C下孵育4周，每周增湿 一次。使用凝集测试沙门氏菌〇抗血清D1群因子1、9、12(BDDifco)测试LB琼脂平板中 的菌落生长。
[0061] 使用肿瘤细胞和ives处理激发小鼠
[0062] 按照如下进行鼠原位模型：将小鼠深度麻醉（使用溶于PBS中的10% Rompun(Bayer,ProvetAG,Lyssach，瑞士）和 10 %Ketanarcon(StreuliPharma,Uznach, 瑞士）的混合物（每l〇g体重100μ1)进行腹膜内麻醉），使用Introcan 24G/3/4(Braun，Melsungen，Germany)插入导管，在用22%的乙醇预处理15分钟后在膀胱 中滴注200'000个MB49-1UC细胞（第1天）。在腹膜内注射D-荧光素（Promega，150μg/ g体重）后 15 分钟在Xenogen成像系统（Xenogen/CaliperLifeScience，由cellular imagingfacility(CIF)，UNIL,Lausanne,Switzerland惠供）中通过生物发光监测肿瘤生 长。在肿瘤消退测定实验中，按照Mangsboetal.，2008所公开的方案，在第2、9、16和23 天进行处理。
[0063] 细菌存活
[0064] 通过在小鼠中ives滴注进行体内细菌存活测定，将所述小鼠在不同时间点通过 〇)2吸入处死，以回收脾、BLN和膀胱。在蔗糖溶液中将器官匀浆，然后根据所接受的处理在 LB或M7H11中涂布（分别为Ty21a或BCG)。
[0065] 对于体外细菌存活测定，在37°C下使用不同Μ0Ι的Ty21a感染细胞系1. 5小时，然 后在37°C下加入50μg/ml庆大霉素1小时以杀死胞外细菌。将细胞培养物维持在15μg/ ml庆大霉素（Gibco，Zug，Switzerland)中。在不同的时间点，用 0.1%Triton-X_100(Sig ma-Aldrich,Buchs,Switzerland)裂解细胞并收集用于在LB琼脂平板中涂布。
[0066] 制备鼠细胞悬液
[0067] 通过C02吸入处死小鼠并收集BLN和膀胱，如之前所述获得单细胞悬液（Revaz，D ebonneville,Bobst, &Nardelli-Haefliger, 2008)。简言之，通过机械解离获得BLN细胞悬 液。切碎膀胱并用〇· 5mg/ml嗜热菌蛋白酶（Roche,Basel,Switzerland)和lmg/ml胶原酶 /分散酶（Roche)逐步消化。将所有的细胞悬液重悬于补充有10%FCS的DMEM培养基中。
[0068] 流式细胞术标记和分析
[0069] 使用以下单克隆抗小鼠抗体对BLN和膀胱细胞进行染色：PE-抗-CDllc(HL3,BD Biosciences,Basel,Switzerland)nPE/TXRD-抗-CD8 (53-6. 7,Southern Biotech,Birmingham,USA)、eF45〇-抗-CD4 (GK15,eBiosciences,Vienna,Austria)、 FITC-抗-IA/IE(M5/114. 15. 2)、PerCp/Cy5. 5-抗-CD3 (17A2)、PE/Cy7-抗-GR1 (RB6-8C5)、 APC-抗-CD1lb(Ml/70)、AF700-抗-NK1. 1 (PK136)、APC/Cy7-抗-F4/80 (BM8)，全部来自于 Biolegend(London,UK)。使用活/死的可固定aqua死细胞染色试剂盒（Invitrogen,Life technologies,Zug,Switzerland)对死细胞进行染色。使用Gallios流式细胞仪 (BeckmanCoulter,Nyon,Switzerland)获得细胞，并使用Flowjo9. 6. 1 软件（Tree Star,Ashland,USA)进行分析。
[0070] 细胞因子分析
[0071] 回收感染的尿道上皮细胞的上清液并贮存于-80°C直至分析。按照制造商的方案， 使用BD细胞计数微珠阵列（CytometricBeadAssay，CBA)人炎症试剂盒分析人细胞系， 以检测和定量以下细胞因子：IL-12p70、TNF、IL-10、IL-6、IL-1β和IL-8。按照制造商的 使用说明，使用BDCBA小鼠炎症试剂盒检测和定量ΜΒ49细胞系的IL-12p70、TNF、IFN-y、 MCP-1、IL-10和IL-6细胞因子。然后使用BDFACSArray生物分析系统分析样品。
[0072] 肿瘤细胞凋亡
[0073] 使用不同Μ0Ι的活的或热灭活的Ty21a感染MB49细胞。感染后24h和72h，回收 细胞，并按照制造商的方案，使用PEAnnexinV细胞凋亡检测试剂盒（BD)用AnnexinV和 7-AAD标记物对细胞进行染色。使用Gallios流式细胞仪（BeckmanCoulter)获得细胞，并 使用Flowjo9. 6. 1软件（TreeStar)进行分析。
[0074] 统计学分析
[0075] 如在正文中或图注中所示，使用针对Windows的Prism6.00(GraphAPad软件， California，USA)进行统计学分析。
[0076] 实施例2 :结果
[0077]IvesTy21a处理提高膀胱癌原位模型中的小鼠存活率
[0078] 使用MB49细胞在原位膀胱癌模型中评估ivesTy21a使膀胱肿瘤消退的可能性。 在细胞表面标记物、对细胞凋亡的敏感度和免疫学特征方面，该小鼠模型类似于人浅表性 膀胱癌（Chen,Zhang,Cao,Hessner, &See, 2009)，其通常已被用于了解和/或评估ivesBCG 免疫疗法（Loskogetal.，2005)。为了确保膀胱肿瘤监测，本发明人使用表达荧光素酶 (luc)的慢病毒载体转导MB49细胞以产生MB49-1UC细胞。在本发明人的设置中，在ives滴 注200'000个MB49-luc细胞之前用22 %乙醇预处理获得接近100 %的成瘤（tumor-take) (关于第8天的代表性实验，参见图1A)。按照该模型中BCG处理的通常方案（Arnold，de Boer, 0,Donnell,Bohle, &Brandau, 2004;Mangsboetal.，2008)，在第 0 天使用 200' 000 个MB49-luc细胞对三组小鼠（每组10只）进行ives滴注，并在第1、8、15和22天用BCG 或Ty21a处理或不进行处理。细菌的剂量由Ty21a的口服疫苗Vivotif的复原胶囊（至 少2X109CFU/胶囊）或BCG的Oncotice小瓶（2-8X10SCFU/小瓶）的1/10组成。示出 了每组中随时间的小鼠存活百分数（图1B)。本发明人的数据表明，与未经处理的小鼠相 比，Ty21a和BCG都能够使肿瘤显著消退。Ty21a导致10只小鼠中的7只发生消退（与未 经处理的小鼠相比，P= 0. 01，使用校正的对数秩检验），而BCG导致10只小鼠中的6只发 生消退（P= 0.01)。本发明人观察到，在首次处理后肿瘤继续生长约两周，但是在第四次 滴注时，大多数小鼠均具有完全消退的肿瘤。本发明人进一步评估了降低的细菌剂量的作 用（图1C)。在第0天已经用200' 000个MB49-luc细胞进行ives滴注的5组小鼠，在第 1、8、15或22天接受1/100或1/1000的Ty21a或BCGives的接种物，或未经处理。Ty21a 的两种剂量（1/100和1/1000)都引起肿瘤消退（分别有17/20和7/10的小鼠消退），都与 对照存在显著差异（分别为P= 〇. 0002和p= 0. 002)。相比之下，仅1/100的BCG接种物 与对照有显著差异（P= 0. 0054)，导致10只小鼠中的7只的肿瘤消退。BCG小瓶的1/1000 诱导10只小鼠中5只中的肿瘤消退，这与对照无显著差异（p= 0. 024)。总之，这些结果表 明，在使原位MB49膀胱肿瘤消退方面，Ty21a比BCG更有效，因为Ty21a在更低剂量时仍然 有效。
[0079]Ty21a细菌不存留于健康膀胱或肿瘤中
[0080] 本发明人首先研究了Ty21a是否能够感染和/或存活于小鼠膀胱中。本发明人对 不同的小鼠组（每组4只）进行ives滴注Ty21a(平均值土SEM7. 9±0· 161og1QCFU/小 鼠），并在不同的时间点将其处死（图2A)。本发明人的结果表明，Ty21a不能够存留于膀胱 中24h以上。此外，滴注后6小时，膀胱中细菌大量减少（少于滴注量的1/100)，最可能是 由于排尿（micturation)。本发明人还确定了向膀胱引流淋巴结（BLN)和脾的侵入；但是， 从这些器官未回收到细菌，证明了缺少Ty21a定殖（colonization)和侵入。由于另一种肠 道沙门氏菌伤寒菌株在瘤内注射后在鼠肿瘤中表现出优先的生态位（niche)(Vendrellet al.，2011)，本发明人检测了ivesTy21a是否可优先地定殖于肿瘤中。本发明人用200'000 个MB49-luc细胞ives滴注不同的小鼠组（每组4只），24h后本发明人进行ives滴注 Ty21a(平均值土SEM8. 19±0. 271og1QCFU/小鼠），一周后两组接受第二剂量，一周后该两 组之一接受第三剂量。在不同时间点处死小鼠，测定CFU/器官（图2B)。本发明人的数据 表明，在膀胱肿瘤中可检测到细菌直至第5天，但是滴注后24h活细菌的数量大大减少（最 高达100000倍）。滴注后一周，本发明人在膀胱肿瘤中未检测到任何细菌，甚至在细菌再 激发之后存留也未增加。因此，Ty21a似乎在肿瘤存在时在膀胱中的停留时间更长（尽管 是少量存在），同样在BLN或脾中也未检测到细菌。这与BCG相反（Biotetal.，2012)，图 2C中的本发明人的数据表明其能够在膀胱肿瘤中存留至少一周。此外，滴注后5天在4只 小鼠中的3只的膀胱BLN中检测到BCG细菌。所有这些结果表明，Ty21a可能是更安全的， 因为与BCG的至少7天相比，它在膀胱肿瘤中仅持续存留不到48小时，并且Ty21a未侵入 深层器官。
[0081]Ty21a在膀胱粘膜中短暂地诱导局部炎性细胞
[0082] 为了评估ivesTy21a的安全性，本发明人检