用于治疗眼睛疾病或病症的人类单核细胞亚群的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般而言涉及人类单核细胞亚群，其用于治疗存在或不存在炎性成分的视 网膜和视神经变性且用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
[0002] 发明背景
[0003] 对中枢神经系统（CNS)组织初始损害后的神经元死亡导致神经毒性的恶性循环， 除非快速恢复体内平衡，否则导致损害蔓延（Doble，1999)。假如诱发的保护和修复机制不 足，则将发生神经元的进一步死亡，这是一种与许多CNS病理学相关的现象，而与其病因或 主要的损害原因无关，包括作为CNS部分的视网膜和视神经的神经细胞。在所有偏离体内 平衡中，常驻型免疫细胞被活化。在CNS中，此类免疫细胞是常驻型小神经胶质细胞。如果 这些细胞未充分被活化，或被活化但未按时消退，其即可进入局部炎症的恶性循环中，这并 非主要病理原因，而是其发展的一部分。使未被按时阻止的免疫活性的不充分局部免疫活 性停止需要炎症消退细胞、新募集且可局部培养成炎症消退细胞的循环单核细胞的帮助。 下文我们将概述其中涉及免疫细胞的眼睛疾病。
[0004] 年龄相关性黄斑变性。（AMD)是一种影响眼睛黄斑区域的疾病，黄斑区域是视网膜 中获得敏锐视力的区域，表现为视网膜下方的视网膜色素上皮层萎缩和光感受器（视杆和 视锥）损失。约10%的AMD患者罹患由于血管生长异常而由视网膜中心部位恶化引起的新 生血管性或渗出性黄斑变性。在AMD发病机理中涉及多种细胞过程，包括视网膜色素上皮 细胞炎症、氧化应激、胆固醇代谢改变和/或功能受损。视网膜中的异常血管增生受到血管 内皮生长因子（VEGF)的刺激。
[0005] 葡萄膜炎被认为是由诸如类风湿性关节炎或强直性脊柱炎的自体免疫病症、感染 或暴露于毒素引起的。然而，在许多情形下，病因未知。葡萄膜炎最常见的形式是前葡萄膜 炎，牵涉到眼睛前部的炎症。炎症可与自体免疫疾病相关，但大多数情形发生在健康人群 中。后葡萄膜炎是一种影响眼睛脉络膜和神经视网膜的潜在性致盲的眼部炎症病况。许多 研究已证实巨噬细胞在实验性自体免疫葡萄膜炎（EAU)中起重要作用，实验性自体免疫葡 萄膜炎是人类后葡萄膜炎的一种模型，主要在疾病的诱发和效应阶段的情形下，尽管几项 报道已表明在控制阶段也存在巨噬细胞。然而，在大多数这些研究中，在常驻型小神经胶质 细胞与浸润性巨噬细胞之间不存在功能性区别。另外，关于源自单核细胞的巨噬细胞的不 同子集的特征及其在疾病不同阶段的活体内功能尚无报道。
[0006] 色素性视网膜炎（RP)，一种视网膜营养不良的形式，是一类遗传性病症，其特征是 周边视觉逐渐丧失和可导致中心视觉丧失的夜间视觉困难（夜盲症）。RP由视网膜的光感 受器（视杆和视锥）或视网膜色素上皮细胞（RPE)异常引起，导致视力逐渐丧失。显示RP 中持续性慢性炎症反应的临床迹象，表明炎症可构成RP的发病机理（Yoshida等人，2013)。
[0007] 糖尿病视网膜病变是由糖尿病并发症引起的视网膜病变，最终可导致失明。糖尿 病导致视网膜中的大量代谢和生理异常，但这些异常中哪些造成糖尿病视网膜病变（DR) 的确认特征尚不清楚。已发现在糖尿病患者的视网膜中发展的许多分子和生理异常都与炎 症一致。另外，已发现许多消炎疗法显著抑制DR的不同方面在动物模型中的发展（Tang等 人，2011)。
[0008] 青光眼是一种在老年人群中具有高发病率（约1% )的进展缓慢的视神经病变。 直到最近，其与高的眼内压（Ι0Ρ)联系在一起且因此集中致力于通过抗高血压性药物来减 缓疾病的发展。多年以来，很显然青光眼是一种疾病家族且并非全部与压力相关。此外，显 然即使当疾病与压力相关时，后者仍可降至正常且甚至低于正常值并可以继续变性。临床 医生间持续进行的讨论已质疑不管Ι0Ρ值是否正常，青光眼患者中的持续变性是否反映除 压力以外存在其它风险因素或反映剩余神经元和纤维的脆弱性增加且因此需要使I0P减 小至低于正常值。青光眼尤其导致视网膜神经节细胞（RGC)的神经变性，从而导致视野逐 渐丧失直至视力丧失。
[0009] 病因。成人CNS的急性和/或慢性神经元损失由于成熟神经细胞增生和补偿损 失神经元的能力极差而导致不可逆转的功能损失。因此，减弱或减少神经元损失对于保持 功能而言是必需的。在大多数神经变性疾病中，病因不明确，因此无法治愈。尽管如此，仍 存在一些主要和次要的风险因素，这是旨在抑制或减弱神经元损失进程的治疗性干预的目 标，统称为神经保护性疗法。某些风险因素具有疾病特异性，但其它风险因素（如兴奋性氨 基酸、自由基和一氧化氮）是所有神经变性病症所常见的。这些因素是健康CNS中的必需 自有组成部分，但随着其在变性组织中的过量积聚，将变得具有细胞毒性，导致损害超越神 经元死亡的最初起因而蔓延。
[0010] 谷氨酸是急性和慢性变性病症中最常见的毒性介质之一（Pitt等人，2000)。谷氨 酸是人类CNS中的一种主要的兴奋性神经递质。L-谷氨酸存在于大多数突触中且能够展示 双重活性：它在正常充当必需神经递质中发挥关键作用，但当超过其生理学水平时即具有 毒性。
[0011]目前疾病管理。目前尚无对于神经变性疾病的疗法，且治疗重在缓解或管理症状。 神经保护性疗法在迄今进行的大多数临床研究中均无法显示功效。关于AMD，抗血管新生或 抗VEGF药剂在直接注射至眼睛的玻璃体液中时可导致异常血管退化并改善视力。
[0012] 再生医学和保护性自体免疫。再生医学是旨在通过刺激先前不可修复的器官自我 恢复来修复、取代和/或使受损组织和器官再生的新兴领域，包括组织工程化、生物材料和 细胞疗法。细胞更新是周边组织中一种常见的恢复过程，因其在CNS的剩余部分中而在成 人的神经视网膜中受到限制。然而，视网膜祖细胞（RPC)的静止群体在成人期间继续存在 于视网膜睫状体（CB)中且具有分化成视网膜的各种细胞或可能充当免疫调节剂或嗜神经 型药剂来源的潜能。据报道这种休眠的祖细胞龛在视网膜损伤后受到刺激，尽管尚未公开 其潜在的机制。阐明对损伤作出反应而进行操作的治愈过程并寻找使其增强的方式可导致 用于促进神经保护和细胞更新的新疗法的发展，这是此领域的研究目标。
[0013] 除CNS以外，治愈过程需要借助于免疫系统来清除死细胞和细胞碎片并用于支持 再生长和细胞更新。这些过程部分地通过随着治愈的时间进程获得离散表型的不同巨噬细 胞子集来调节。在对任何损害作出反应的过程中，存在终止涉及源自单核细胞的巨噬细胞 的局部免疫反应的关键阶段，这有助于总体消炎环境并产生再生所需的生长因子。
[0014] 外周血浸润/募集到病变部位受从病变部位引发的信号控制，这影响大脑-脑脊 液（CSF)屏障。在CNS损伤后有限的自发恢复可部分地归因于单核细胞的有效子集不充分、 过早、自发地募集到病变部位。以上考虑因素已导致发明人遵循采用身体专业康复系统、免 疫系统的新的生理学方法来对付CNS损伤的后果，导致神经保护和恢复。
[0015] 发明人实验室中已展示，用皮肤片段孵育源自血液的单核细胞获得了与文献中 描述的消炎M2单核细胞类似的非炎症表型。将单核细胞注射到损伤的脊髓中在大鼠体 内诱导从脊髓损伤（SCI)更好地恢复（US5, 800, 812;US6, 117, 424和US6, 267, 955)。 在临床研究中对罹患急性切断脊髓损伤的患者测试这种方法，显示令人鼓舞的结果 (TO03/044037;Knoller等人，2005)。发明人也表明，外周血单核细胞库（pool)中富集源 自骨髓的CD115+细胞在小鼠体内增强了SCI后的功能恢复（Shechter等人，2009)。
[0016] 血液单核细胞是具有不同特征和活性的异源细胞群。使用血液单核细胞用于治疗 目的需要确认具有有害功能的细胞和有益的细胞。
[0017] 在人类中，建议可区分三个子集，即⑶14++⑶16 (经典）、⑶14++⑶16++(中间物） 和⑶14dllTD16++(非经典）单核细胞之间⑶16在单核细胞上的表达，但对于其在生理学 和病理学病况中的作用尚未完全理解。最近，发明人发现在CD16+富集的单核细胞在脊 髓损伤后注射到动物的CSF中之后与接受总的单核细胞亚群的动物相比减弱了自发性恢 复。还发现不含CD16表达细胞（CD16)的单核细胞亚群对脊髓损伤后的恢复有益（PCT/ IL2012/050522)。 发明概要
[0018] 本公开一般来说部分地涉及一种具有低相对量的或基本上不含⑶3+细胞、⑶19 + 细胞和CD56+细胞的外周血单核细胞（PBMC)的单核细胞亚群，或一种具有低相对量的或基 本上不含⑶3+细胞、⑶19 +细胞、⑶56 +细胞和⑶16 +的PBMC的单核细胞亚群，其用于抑制 神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒（glutamatetoxicity)或促进视网膜或视神经中 的神经再生，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损。
[0019] 本文还提供一种具有低相对量的或基本上不含⑶3+细胞、⑶19 +细胞和⑶56+细胞 的PBMC的单核细胞亚群，或一种具有低相对量的或基本上不含⑶3+细胞、⑶19 +细胞、⑶56 + 细胞和CD16+的PBMC的单核细胞亚群，其用于治疗眼睛的炎性疾病、病症或病况。
[0020] 本文还提供包含具有低相对量的或基本上不含⑶3+细胞、⑶19 +细胞和⑶56+细胞 的PBMC的单核细胞亚群、或具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19 +细胞、CD56 +细 胞和CD16+的PBMC的单核细胞亚群的组合物，其用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷 氨酸中毒或促进视网膜或视神经中的神经再生，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或 病况而受损。
[0021] 本公开一般来说还涉及包含具有低相对量的或基本上不含⑶3+细胞、⑶19 +细胞 和CD56+细胞的PBMC的单核细胞亚群、或具有低相对量的或基本上不含CD3 +细胞、CD19 +细 胞、CD56+细胞和CD16 +的PBMC的单核细胞亚群的组合物，其用于治疗眼睛的炎性疾病、病 症或病况。
[0022] 本文还提供用于抑制神经元变性、保护神经元免于谷氨酸中毒或促进视网膜或视 神经中的神经再生的方法，其中视网膜或视神经因眼睛疾病、病症或病况而受损，所述方法 包括向有需要的个体施用有效量的具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19 +细胞和 CD56+细胞的PBMC的单核细胞亚群或具有低相对量的或基本上不含CD3 +细胞、CD19 +细胞、 CD56+细胞和CD16 +细胞的PBMC的单核细胞亚群。
[0023] 本公开一般来说还涉及用于治疗眼睛炎性疾病、病症或病况的方法，包括向有需 要的个体施用有效量的具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19 +细胞和CD56+细胞的 PBMC的单核细胞亚群或具有低相对量的或基本上不含CD3+细胞、CD19 +细胞、CD56 +细胞和 ⑶16+细胞的PBMC的单核细胞亚群。
【附图说明】
[0024] 图1A-E显示注射到玻璃体中的同系单核细胞在谷氨酸中毒后具神经保护性。在 谷氨酸中毒后7天对无损伤、有损伤和经单核细胞处理的视网膜切片中的视网膜神经节细 胞（RGC)进行定量。对于每一例4个切片的Brn3a+RGC的定量，表示为计数（A)或相对于 无损伤的视网膜的存活百分比（B)。（C-E)无损伤的小鼠（C)和经玻璃体内注射PBS(D)或 小鼠单核细胞（E)的有损伤的小鼠（D-E)的视网膜中RGC的代表性显微照片，用RGC标记 Brn3a进行标记（红色；比例尺100μm)。箭头指向Brn3a+RGC。注意，如在经PBS处理的组 中所见，损伤后RGC损失，且在经单核细胞（小鼠mon)处理的视网膜中，RGC得以保留。整 个图中的条形图显示每组的平均值土SE。*，P〈0. 05;#，P〈0. 01。GT-谷氨酸；mon-单核细 胞；RGC-视网膜神经节细胞。
[0025] 图2A-H显示描绘经玻璃体内注射的小鼠单核细胞的定位和特征的显微照片。谷 氨酸中毒后第7天的视网膜的代表性显微照片，显示经注射的小鼠单核细胞（CX3CR1-GFP， 绿色）对细胞因子和神经营养因子阵列（红色）的表达。（A)TGFi3 ;(B)IL-10;(C)⑶38; (〇)16卩-1;出)8〇即；的厶找-1(精氨酸酶-1);(6)了即-€[ ;01)11-10。用！106(*8七染色剂 (蓝色）对细胞进行非特异性染色。在玻璃体和接近有损伤的RGC处以及在视网膜下间隙 中发现注射的细胞。箭头指向双重标记的细胞；插图显示更高放大倍数的代表性细胞（比 例尺50_m;插图比例10_m)。GCL-神经节细胞层；SRS-视网膜下间隙；vit-玻璃体。
[0026] 图3A-C显示基于保护性CNS的自体免疫疫苗接种在视神经损伤