用于特异性靶向全血中的人cd14+单核细胞的阳离子脂质体递药系统的制作方法
【专利说明】用于特异性靶向全血中的人CD14+单核细胞的阳离子脂质 体递药系统 发明领域
[0001] 本发明涉及使用阳离子脂质体的特异性递送。更具体地，本发明涉及包含脂质和 至少一种活性成分的脂质体，其中至少一种脂质是阳离子脂质；所述脂质体在生理条件下 展示出净正电荷，此时所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细胞；本发明还涉及基 于脂质的包含所述脂质体的药物组合物及其在与单核细胞相关的预防、治疗或改善病症中 的应用。
[0002] 发明背景
[0003] 脂质体是由包封水性芯的脂双层组成的脂质囊泡。这些囊泡因几个原因而被视为 具有作为递药系统的巨大潜能：i)可以递送不同类型的药物；可以将亲水性药物载入水性 隔室或可以使疏水性药物锚着在膜内；ii)治疗效能通过靶向特定组织而得到增强，导致 所递送药物的生物利用度提高；和iii)副作用显著减少，因为仅患病组织暴露于施用的药 物。作为结果，在过去几十年已经广泛地研宄了脂质体，以尝试研发新制剂用于治疗例如癌 症（1，2, 3)和炎症（4, 5)，而且靶向特定组织，例如脑、线粒体、眼表面和真皮。
[0004] 脂质体在减少达到靶部位的药量施用后被单核巨噬细胞系统（MPS)的摄取被视 为早期脂质体递药系统的主要缺陷之一。MPS由血液中的单核细胞、骨髓中的其前体细胞和 组织巨噬细胞组成。单核细胞不同于骨髓中的造血干细胞，从其中它们释放入血液中。它 们可以循环几天，此后它们作为促炎、代谢或免疫刺激物的产物离开脉管系统，迀移入组织 并分化成巨噬细胞或树突细胞。尤其是在肝、脾和淋巴系统中发现的组织巨噬细胞具有高 度吞噬细胞活性并且促成凋亡细胞以及施用的脂质体清除。血液中的单核细胞还在通过吞 噬作用消除病原体和凋亡宿主细胞方面起重要作用。
[0005] MPS的细胞的吞噬细胞的能力可以通过靶向血液中的细胞而被转化成优势，所述 血液中的细胞通常不需要地摄取施用的脂质体制剂，即单核细胞。单核细胞是第一种补充 至炎症或感染部位的细胞，使得单核细胞成为第一线防御并且调节疾病的重要成分。单核 细胞、巨噬细胞和树突细胞在免疫细胞中具有3种主要的功能；吞噬作用、抗原呈递和细 胞因子产生。它们在急性和慢性炎症中起关键作用，因为它们通过分泌促炎细胞因子例如 TNF-a、IL-I β和IL-6维持炎症条件。全身给予的抗炎药存在不良副作用+定位于健康 组织或快速地被排泄，这是可以通过使用特定递药系统防止发生的一个问题。因此，靶向递 送至单核细胞具有巨大重要性。
[0006] Karathanasis等人（6)已经研宄了包含特定带正电荷肽称作GGP的脂质体制剂的 摄取。他们发现，这些脂质体制剂可以选择性地靶向中性白细胞和单核细胞，而且依赖于肽 的序列，而不依赖于正电荷，因为不靶向具有相同正电荷的对照肽没有增强脂质体摄取。然 而，据报道脂质体的电荷对脂质体的细胞摄取具有显著影响。Lee等人（7)研宄了中性与带 负电荷的脂质体在作为混悬液的胎牛血清的存在下对培养基中培养的人单核细胞细胞系 或体外粘着细胞的相互作用关系。他们发现，带负电荷的脂质体的摄取依赖于单核细胞的 成熟状态。当细胞分化成巨噬细胞时，带负电荷的脂质体的摄取增加了 5-倍，而中性脂质 体的摄取仍然保持不变。相同的结果还发生在制剂在混悬液形式的单核细胞培养物中的摄 取的情况中。以前还报道了带负电荷的脂质体被人巨噬细胞细胞系J774的摄取（8, 9)。
[0007] 已经在非病毒转染的系统中研宄了阳离子脂质体，这归因于其浓缩RNA/DNA的 能力和一般地被许多细胞类型非选择性地吸收内在化而得到的脂复合物的高正电荷 (1，2, 3, 10, 11，12)。已经报道阳离子肽类对细胞具有毒性，但这种作用可以通过在脂质体 制剂中添加共-脂质或共聚物而防治发生0。
[0008] US 6, 120, 799公开了选择性地被脂质/DNA复合物或阳离子脂质体靶向的血管生 成内皮细胞。
[0009] US2010/0068212A1涉及用于靶向致病性单核细胞的方法。
[0010] US2002/0155609A1公开了单核细胞特异性颗粒递送载体。
[0011] US2007/0292494A1公开了碳水化合物-衍生的脂质体，其用于靶向CTL/CTLD外源 凝集素的细胞碳水化合物识别结构域，以便将活性剂在胞内递送至储库细胞，其感染或易 感传染原，例如HIV。
[0012] US 2005/0142114A1涉及用于将药物递送至骨髓和淋巴样免疫细胞的靶向脂 质-药物制剂。
[0013] US 2009/0232731公开了用于治疗类风湿性关节炎的阳离子脂质体制剂。
[0014] WO 2007/134819A1公开了阳离子脂质体制剂在治疗或诊断类风湿性关节炎或相 关疾病中的应用。
[0015] WO 2011/098578A2公开了用于眼内施用的脂质体，从而能够使得活性药物成分缓 释或延迟释放。
[0016] Zhou D.等人在 "The role of surface charge in monocyte activation and cell viability induced by cationic liposome"，ACTA BIOPHYSICA SINICA,第 26 卷， 第 8 期，2010 年 9 月 20 日，第 726-734 页，XP002692700，USSB:1000-6737 中公开了带有不 同表面电荷的阳离子脂质体对单核细胞活化和活力的作用。
[0017] 带正电荷的脂质体可以展示出细胞毒性活性（Lv J Control Release. 2006年8 月 10 日；114(1) :100-9 和 C. Kelly 等人 J Drug Deliv. 2011:article ID 727241)。
[0018] 阳离子脂质体用于例如在基因递送技术或基于寡核苷酸的敲除技术中递送核酸 (14)〇
[0019] 如果脂质体递药系统用于免疫调节，则该制剂必须被单核细胞摄取，而不被血液 中的其他细胞群摄取。本发明提供了选择性地被新鲜全血中的单核细胞摄取的脂质体制 剂。为了达到这一目的，研宄了不同脂质体制剂与血液中的特异性细胞群之间的相互作用。
[0020] 发明概述
[0021] 已经令人意外地发现，在生理条件下带有净正电荷的脂质体能够在新鲜全血中温 育时选择性地靶向单核细胞。
[0022] 根据第一个方面，本发明涉及用于靶向单核细胞的脂质体，其包含脂质和至少一 种活性成分，其中至少一种脂质是阳离子脂质；所述脂质体在生理条件下展示出净正电荷， 此时在与粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞比较时 所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细胞，由此能够选择性地靶向存在于血液或组 织中的单核细胞并且与之结合。
[0023] 带正电荷的脂质体通过细胞膜结合、吞噬作用或胞吞作用显示优先结合单核细胞 并且保留在那里。这些机制可以由补体系统诱导，所述补体系统在新鲜人体血液中具有活 性，而在血液、血浆和血清的贮存或冷冻过程中失活。几种补体因子显示分钟范围内的生物 半衰期。
[0024] 根据第二个方面，本发明涉及基于脂质的用于靶向新鲜血液中的单核细胞的递送 系统，该系统提供将至少一种活性成分递送至靶向的单核细胞并且在那里释放，所述系统 包含：
[0025] (I)脂质，其包含：
[0026] 至少一种阳离子脂质；和
[0027] (II)至少一种活性成分；
[0028] 所述脂质能够形成脂质体，所述脂质体包含至少部分所述至少一种活性成分；所 述脂质体在生理条件下展示出净正电荷，此时在与粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋 巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞比较时所述脂质体优先粘附新鲜抽取血液中的单核细 胞。
[0029] 根据第三个方面，本发明涉及包含本发明第一个方面的脂质体的药物制剂。
[0030] 本领域技术人员认为适合的赋形剂包括在这种药物制剂中。然而，参照下文的详 细公开内容。
[0031] 根据另一个方面，本发明涉及本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的 脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物，它们用作药物。
[0032] 本发明的脂质体、脂质递送系统或药物组合物可以用作用于预防、治疗或改善许 多如下文更详细公开的病症的药物。
[0033] 根据另一个方面，本发明涉及本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的 脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物，它们用于与单核细胞相关的预防、治疗 或改善。
[0034] 因此，通过靶向在免疫系统中起关键作用的单核细胞，能够定制递送至期望的作 用部位的药物。
[0035] 根据另一个方面，本发明涉及本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的 脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物在制备用于与单核细胞相关的预防、治疗 或改善的药物中的应用。
[0036] 根据另一个方面，本发明涉及体外活化/抑制单核细胞的方法，包括下列步骤：
[0037] i)提供新鲜血液；
[0038] ii)将权利要求1-28任一项的脂质体、权利要求29的脂质递送系统或权利要求 30的药物组合物施用于所述新鲜血液；
[0039] iii)使得所述脂质体、脂质递送系统或药物组合物反应。
[0040]因此，能够分析单核细胞级分的单核细胞功能的免疫刺激或免疫抑制。
[0041] 根据另一个方面，本发明涉及体内活化/抑制哺乳动物中单核细胞的方法，包括 下列步骤：将本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明第 三个方面的药物组合物以足以活化/抑制所述单核细胞的用量施用于所述哺乳动物。
[0042] 根据另一个方面，本发明涉及体内活化/抑制哺乳动物中单核细胞的方法，包括 下列步骤：
[0043] i)提供来自有此需要的哺乳动物的新鲜血液；
[0044] ii)将本发明第一个方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明 第三个方面的药物组合物施用于所述新鲜血液；
[0045] iii)使得所述脂质体、脂质递送系统或药物组合物与所述新鲜血液反应；
[0046] iv)将所述血液再导入所述哺乳动物循环。
[0047] 因此，诱导或抑制免疫功能通过所述哺乳动物中的单核细胞起作用，而不是直接 将所述脂质递送系统或药物施用于该哺乳动物。
[0048] 根据另一个方面，本发明涉及用于预防或治疗或改善癌症、感染性疾病、炎性疾 病、自身免疫疾病或过敏症的方法，包括对有此需要的受试者施用有效量的本发明第一个 方面的脂质体、本发明第二个方面的脂质递送系统或本发明第三个方面的药物组合物。
【附图说明】
[0049] 图1:脂质体、脂质体大小和表面电荷的概述。⑷由1-棕榈酰基-2-油酰 基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油 (POPG)和1，2_二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000] (D0PE-PEG2000)组成的脂质体列表。显示了脂质体中每种成分的比例。（B)以mV表示的 脂质体表面电荷。（C)以纳米（nm)测量的脂质体大小。B和C的脂质体组合物是指来自图 IA的编号。
[0050] 图2:包含POPC (制剂3和4)的添加或不添加负电荷（P0PG，制剂1和2)或 正电荷（D0TAP，制剂5和8)脂质的脂质体制剂的摄取。（A)用作全血样品中5种不同 细胞群的标记的抗体；⑶14 (单核细胞标记）、⑶15 (粒细胞标记）、⑶3 (T-淋巴细胞标 记）、⑶19 (B-淋巴细胞标记）和⑶56 (NK细胞标记）。（B)包含RhB的6种不同脂质 体制剂的摄取的FACS分析（分别为图IA中的组合物1-4、8和5) (P0PC:P0PG 90:10、 P0PC:P0PG:D0PE-PEG200090:5:5, POPC, POPC:DOTAP:D0PE-PEG200090: 5: 5, POPC:DOTAP 90:10、P0PC:D0TAP:D0PE-PEG200080:15:5)。将数据表示为对显示为平均值土SD的RhB为 细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析（one-way AN0VA)来分析每个组。当比较2个值 时，使用双-尾t-检验（林*Ρ〈0· 001，*林*Ρ〈0· 0001)。（C)显示5种细胞群中阳性细胞的 门控的有代表性的示意图。
[0051] 图3:显示0、5、15和60min温育后脂质体制剂3 (A)和8 (B)的摄取。将数据表示 为对显示为平均值土SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析来分析每个组 0***P〈〇. 0001)。（C)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性的示意图。
[0052] 图4:包含RhB(图1A)的浓度为0、50、250和500mM的脂质体制剂3⑷和8(B) 的摄取。将数据表示为对显示为平均值土SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单因素方 差分析来分析每个组0***P〈〇. 0001)。（B)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性 的示意图。
[0053] 图5:分析正电荷对不同细胞群中摄取的作用。（A)包含0-50mol% DOTAP的脂质 体制剂的摄取（图IA中的组合物3和6-12)。将数据表示为对显示为平均值土SD的RhB 为细胞阳性的百分比。通过单因素方差分析来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾 t-检验（***P〈0. 001，****P〈0. 0001，ns =无显著性）。（C)显示5种细胞群中阳性细胞的 门控的有代表性的示意图。
[0054] 图6:显示在37C旋转下血液温育0、2h和4h后包含RhB(图1A)的脂质体制剂3(A) 和8 (B)的摄取。将数据表示为对显示为平均值土SD的RhB为细胞阳性的百分比。通过单 因素方差分析来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾t-检验〇P〈0. 05，***P〈0. 001， ****P〈〇. 0001)。（C)显示5种细胞群中阳性细胞的门控的有代表性的示意图。
[0055] 图7:使用包含0-50% DOTAP的脂质体（图IA中的组合物3和6-12)对人单核细 胞细胞系THP-I测定脂质体的细胞毒性。使用4种不同浓度的脂质体：5、50、250和500 μ M。 (A) 60min温育后THP-I细胞中的脂质体摄取的FACS分析。（B)使用细胞培养基洗涤前将 脂质体与细胞一起温育60min。24h后，通过FACS测定与细胞结合的膜联蛋白V。将星状孢 子素用作细胞凋亡的阳性对照。（C)显示膜联蛋白V阳性细胞门控的有代表性的示意图。 (D)使用细胞培养基洗涤前将脂质体与细胞一起温育60min。24h后，通过与XTT -起温育 4小时测定脂质体诱导的细胞毒性。（E)XTT温育后显示细胞的相差显微镜检查照片。将数 据表示为脂质体摄取的MFI (A)、膜联蛋白V阳性的细胞百分比（B)或显示为平均值土SD 的吸光度（D)。通过单因素方差分析来分析每个组。当比较2个值时，使用双-尾t-检验 (***Ρ〈0· 001，****Ρ〈0· 0001，ns =无显著性）。
[0056] 本发明的详细公开内容
[0057] 定义
[0058] 本申请和权利要求中的"脂质体"表示由至少一种脂双层构成的人工制备的囊 泡。
[0059] 作为本文上下文中使用的术语"优先粘附"是指本发明的脂质体粘附新鲜抽取的 血液中的单核细胞的程度是粘附新鲜抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和 /或NK细胞的至少1. 5倍，优选至少2倍，例如至少3倍，更优选至少4倍，例如是粘附新鲜 抽取的血液中的粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞和/或NK细胞的至少5倍。
[0060] 本文上下文中的术语"新鲜抽取的血液"是指在从哺乳动物中抽取的不超过60分 钟、例如不超过30分钟、优选不超过15分钟、不超过10分钟、例如不超过5分钟的所述血 液。
[0061] 本文上下文中的术语" ζ电位"描述相对于离开界面的大量流体中的点的溶液中 胶粒滑面位置上的电位。将本文上下文中用于脂质体X的术语"相对ζ电位"定义为（X 的ζ电位减去图1的脂质体6的ζ电位（5% DOTAP))除以（图1的脂质体11的ζ电位 (20% D0TAP)减去图1的脂质体6的ζ电位（5% D0TAP)之差）χ 100 ;在与实施例2中详 细公开的相同的条件下在10%蔗糖缓冲液中测定。
[0062] 术语"免疫原性"是指能够诱导免疫应答。
[0063] 作为本文上下文中使用的术语"致耐受性"是指能够减量调节免疫应答。
[0064] 当本文使用术语〃基本的〃/〃基本上的〃或〃主要的〃/〃主要地〃时，它预以表 示的是通过这些术语描述的特征以一定量存在或具有一种影响，所述量或影响提供与请求 保护的本发明实施相关的技术效果。例如，组合物中物质的"基本的量"是提供该物质所 显示的技术效果的量，其程度为提供本发明方面的技术效果。同样，如果组合物显示为包含 〃基本上不含〃颗粒物质，则这是允许该组合物包括不显著量的物质，条件是这些量对组合 物中的其他成分不具有任何技术影响且在其自身方面不能"存在差异"-或换句话说，"基 本上不含"和"主要地不含"是指例如可能存在痕量或微小的效果，条件是它们不具有总 体技术影响。
[0065] 本发明的具体实施方案
[0066] 本发明另外的实施方案如下所述。本领域技术人员显而易见，可以合并本发明的 方面和/或实施方案。
[0067] 本发明的一个实施方案是具有15-85%的ζ电位的脂质体。
[0068] 正如从本文报道的结果中显而易见的，本发明的脂质体以15-85%的相对ζ电位 选择性地粘附单核细胞。
[0069] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述脂质体适合于静脉内施用。
[0070] 本发明的一个实施方案是具有20-80%的相对ζ电位的脂质体。
[0071] 本发明的一个实施方案是具有25-75%的相对ζ电位的脂质体。
[0072] 更具体地，相对ζ电位在20-80%的范围，甚至更具体地在25-75%的范围。在这 些范围内，对于单核细胞的选择性与其他血液成分例如粒细胞、T-淋巴细胞、B-淋巴细胞 和/或NK细胞相比甚至更显著。
[0073] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述脂质体包含低于20%、例如低于 10%、优选低于5%、更优选低于2%的胆固醇，最优选基本上不含胆固醇。
[0074] 脂质体结构和特征
[0075] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中至少部分脂质选自磷脂类、留醇类和甾醇 衍生物。
[0076] 本发明的一个具体的实施方案是脂质体，其中所述脂质包含或构成选自磷脂酰胆 碱（PC)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰丝氨酸（PS)、磷脂酰甘油（PG)、磷脂酰肌醇（PI)、磷脂 酸（PA)、DPG (双磷脂酰甘油）、PEOH (磷脂酰醇）、胆固醇、麦角固醇和羊毛留醇的成员。
[0077] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述磷脂酰胆碱类选自1，2-二油酰基-磷 脂酰胆碱、1，2-二棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1，2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、1，2-二硬脂酰 基 -磷脂酰胆喊、1_油酰基_2_棕榈酰基-磷脂酰胆喊、1-油酰基_2_硬脂酰基-磷脂酰 胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱。
[0078] 本发明的一个实施方案是脂质体，其中所述磷脂酰胆碱类选自1，2-二油酰基-磷 脂酰胆碱、1，2-二棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1，2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、1，2-二硬脂酰 基 -磷脂酰胆喊和1_棕榈酰基_2_油酰基-磷脂酰胆喊。
[0079] 本发明的一个具体的实施方案是脂质体，其中所述脂质包含1，2-二油酰基-磷脂 酰胆碱。
[0080] 本发明的另一个实施方案是脂质体，其中所述磷脂酰乙醇胺类选自1，2-二油酰 基-磷脂酰乙醇胺、1，2-二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、1，2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺、 1，2-二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺、1-油酰基-2-硬 脂酰基-磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰 基-磷脂酰乙醇胺和N-琥珀酰基-二油酰基-磷脂酰乙醇胺；所述磷脂酰丝氨酸类选自 1，2-二油酰基-磷脂酰丝氨酸、1，2-二棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、1，2-二肉豆蔻酰基-磷 脂酰丝氨酸、1，2-二硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰丝氨酸、 1-油酰基-2-硬脂酰基-磷脂酰丝氨酸、1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸和1-硬 脂酰基-2-油酰基-磷脂酰丝氨酸；所述磷脂酰甘油类选自1，2-二油酰基-磷脂酰甘油、 1，2-二棕榈酰基-磷脂酰甘油、1，2-二肉豆蔻酰基-磷脂酰甘油、1，2-二硬脂酰基-磷脂 酰甘油、1 _油酰基_2_棕榈酰基-磷脂酰甘油、1-油酰基_2_硬脂酰基-磷脂酰甘油、1-棕 榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油和1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油；所述磷脂酸类 选自二-棕榈酰基-甘油磷脂酸、二-硬脂酰基-甘油磷脂酸、二-肉豆蔻酰基-甘油磷脂 酸、二-油酰基-甘油磷脂酸、棕榈酰基-油酰基-甘油磷脂酸。
[0081] 本发明的另一个实施方案是脂质体，其中所述脂质包含或构成：磷脂酰甘油 (PG)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰丝氨酸（PS)、磷脂酰胆碱（PC)