长链非编码rna基因loc553103的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体设及利用长链非编码RNA基因L0巧53103 制备监测胃癌复发转移和预后预测制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 邸病毒巧psteinBarrvirus,邸V)是一种普遍存在的人类瘤疹病毒，可W感染全 球95%左右的成人人口，除偶尔有一小部分人会引起传染性的单核细胞增多症外，大部分 被感染者不会出现任何的临床症状，绝大多数情况下邸V可W在宿主体内长期潜伏感染。 然而，在某些情况下潜伏感染的邸V会导致恶性肿瘤的发生，包括B细胞来源的伯基特和何 杰金氏淋己瘤，化及上皮细胞来源鼻咽癌和胃癌等。邸V导致恶性肿瘤发生的机制目前尚未 完全明了，可能与邸V本身编码一系列基因的表达有关，如邸V编码的潜伏膜蛋白ULatent MembraneProteinl，LMP1)作为一种致瘤蛋白，能激活许多宿主细胞内癌基因的表达，抑制 抑瘤基因的结构和功能。
[0003] EBV作为双链DNA病毒其基因组大小约为170化，除了可转录一系列蛋白编码基 因外，最近还发现EBV也可编码一类微小RNA(microRNA，miRNA)分子。miRNA是一种长约 20~25nt的调控型非编码RNA，与mRNA不同，miRNA不是DNA和蛋白质之间的"桥梁"，而 是通过与目的基因祀向结合，调控基因的表达水平。邸V是第一个被发现可编码miRNA的病 毒，进入宿主后邸V即开始表达产生miRNA,发挥生物学作用。目前已发现邸V可编码25个 miRNAs前体，加工成44个成熟的miRNAs，且EBV编码的miRNAs在EBV基因组上成簇分布， 可W分为BART和BHRF1两组。EBV编码的miRNAs可能通过调控EBV本身编码的基因或者 宿主细胞内的基因，从而参与了邸V介导的肿瘤恶性转化，影响包括鼻咽癌、胃癌、淋己瘤 等在内的多种肿瘤的发生发展。然而目前对于邸V编码miRNAs的研究还不是很透彻，44个 成熟的邸VmiRNAs中大部分还没有功能研究的报道，比如有关邸V编码的miRNABART6-化 的作用及机制的研究就很少。迄今为止有关BART6-化在鼻咽癌、胃癌等实体瘤发生发展中 的作用的关系及其在实体瘤病人的早期筛查、辅助诊断或者疗效预测等方面均没有文献报 道。
[0004] 我们通过研究表明，BART6-化在鼻咽癌和胃癌组织中的表达均显著升高，但是非 常有意思的是在鼻咽癌和胃癌组织中BART6-化的表达水平与鼻咽癌和胃癌患者的复发转 移呈负相关关系，低表达BART6-化的患者比高表达BART6-化的患者更容易发生复发和 转移，预后更差。运表明尽管邸V是比较明确的致瘤性病毒，但并非邸V编码的基因全部 都具有促进肿瘤发生发展的作用，部分基因，包括BART6-化可能具有抑瘤功能，运也表明 邸VmiRNAs的表达水平与肿瘤复发、转移预后等临床表型的关系不能推测，只能通过具体 而细致的实验研究才能确定。因此，针对BART6-化设计专用原位杂交探针及检测试剂盒， 或者利用BART6-化特异性引物进行实时巧光定量PCR等技术检测鼻咽癌和胃癌组织中 BART6-化的表达水平有望为临床上对肿瘤进行复发和转移的预测提供参考。 阳0化]我们在鼻咽癌及胃癌细胞中转染人工合成的BART6-化，证实在邸V阴性的鼻咽癌 和胃癌细胞中表达BART6-化可W明显抑制肿瘤细胞的生长增殖W及侵袭转移能力。因此，BART6-化又可W用于制备抑制肿瘤细胞生长、增殖和预防肿瘤细胞侵袭转移的制剂。
[0006] 我们还设计了一系列的实验检测了BART6-化在鼻咽癌和胃癌细胞中发挥生物学 功能的分子机制，我们发现BART6-化可抑制细胞内一个长链非编码RNA(longnon-coding RNA，IncRNA)基因L0C553103 的表达巧eferenceSequence:NR_110997)，我们设计了针对 L0C553103的RNA干扰序列（siRNA)转染鼻咽癌和胃癌细胞，抑制L0巧53103的表达后，细 胞出现类似转染BART6-化的细胞生物学表型，即抑制肿瘤细胞生长和增殖W及抑制肿瘤 细胞侵袭与转移能力。因此，针对L0巧53103的RNA干扰序列（siRNA)也可W用于制备抑 制肿瘤细胞生长、增殖和预防肿瘤细胞侵袭转移的制剂。此前，有关L0巧53103的功能未见 任何文献报道。
[0007] 细胞骨架是真核细胞中由微管、微丝和中间纤维=种蛋白纤维搭建而成的存在于 胞浆内的网络结构，=种成分高度协调分布，将胞核、质膜、各细胞器连在一起，构成了细胞 形态维持和运动协调的支持系统。近年来的研究表明肿瘤细胞运动迁移和侵袭能力与细胞 骨架的动态调控密切相关，祀向细胞骨架的药物也可W诱导肿瘤细胞调亡抑制肿瘤细胞的 增殖。我们通过系列实验证实了BART6-化可通过祀向抑制宿主细胞中L0巧53103的表达， 影响肿瘤细胞中微管微丝的组装，调控细胞骨架的重构，最终导致肿瘤细胞生长、增殖、侵 袭、转移等表型的变化。因此，BART6-化和针对L0巧53103的RNA干扰序列（siRNA)还可 W用于制备抑制肿瘤细胞骨架组装和重构的制剂。
[0008] 另外，我们又在鼻咽癌和胃癌的临床样本中检测L0巧53103的表达状况，发现其 在癌旁对照组织中高表达，而在大部分肿瘤组织中低表达，且与BART6-化的表达呈负相 关，L0C553103的表达可W作为患者预后的指标，因此，针对L0巧53103设计专用的实时巧 光定量PCR引物及检测试剂盒或原位杂交探针及检测试剂盒，用于检测鼻咽癌和胃癌组织 L0C553103的表达水平有望为临床上对运两种肿瘤进行复发转移及预后预测提供参考。
[0009] 总么我们的研究掲示了BART6-化及一个新的IncRNA基因L0C553103在鼻咽癌 和胃癌等恶性肿瘤发病过程中的功能，为BART6-化和L0巧53103的应用方法提供了实证。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA基因L0C553103的应用，具体是利用 基因L0巧53103的序列制备用于监测胃癌复发转移和预后预测的制剂，包括：实时巧光定 量PCR引物及试剂、原位杂交探针及原位杂交检测试剂盒等。
[0011] 长链非编码RNA基因L0C553103的应用，L0C553103用于制备监测胃癌复发转移 和预后预测的制剂；胃癌组织中L0C553103的表达水平与胃癌的复发转移呈正相关关系， 且与胃癌患者的不良预后密切相关；该基因在NCBI中的序列号：NR_110997。
[0012] 所述的监测胃癌复发转移和预后预测的制剂为实时巧光定量PCR检测制剂或原 位杂交检测制剂。 阳01引所述的实时巧光定量PCR检测制剂包括：
[0014] L0C553103正向引物：5' -ACAGTAGTGCGATCAAGGCT-3'；
[0015] L0C553103反向引物：5, -TCACCACCTCCCTGTTCTTC-3,。
[0016] 所述的实时巧光定量PCR检测制剂还包括：内参基因GAPDH特异性PCR引物：
[0017]正向引物5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 阳01引反向引物5, -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,。
[0019] 所述的原位杂交检测制剂包括：
[0020] L0C553103探针序列-1 :5' -CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3'
[0021] L0C553103探针序列-2 :5' -ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3'
[0022] L0C553103探针序列-3 :5' -ACACUUUGAAAUUUUUGUCACCUCCCUUGA-3'。
[0023] 所述的原位杂交检测制剂还包括：阳性对照探针：
[0024] GAP畑探针序列-1 :5' -CCACUUUACCAGAGUUAAAAGCAGCCCUGG-3' 阳02引 GAP畑探针序列-2 :5' -CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCUGGAGAG-3,
[0026] GAP畑探针序列-3 :5' -GUCAGAGGAGACCACCUGGUGCUCAGUGUA-3'。
[0027] 所述的原位杂交检测试剂为试剂盒。
[0028] 试剂盒还包括：
[0029] 地高辛寡核巧酸加尾试剂、抗地高辛-辣根过氧化物酶复合物检测试剂、DAB染色 试剂；其它常规生物化学试剂，包括20xSSC，硫酸葡聚糖，去离子甲酯胺，多聚腺巧酸，多聚 脱氧腺巧酸，变性剪切的娃精DNA，酵母转运RNA，二硫苏糖醇，50址enhar化s'Ssolution, PBSbuffer,胃蛋白酶K，牛血清白蛋白，S乙醇胺，醋酸酢，
[0030] TNB缓冲液：pH7.5的0.1MTris-Cl+0.15MNaCl+0.5%阻断试剂；
[0031] TNT缓冲液：pH7. 5的0. 1M Tris-Cl+0. 15M NaCl+0. 05% Tween 20。
[0032] 我们通过实时巧光定量PCR检测，W及原位杂交在存档的胃癌石蜡组织标本中发 现L0巧53103的表达与胃癌患者的预后密切相关，在胃癌组织中检测到L0巧53103的表达 水平与胃癌患者的转移呈正相关关系，L0C553103表达高的患者生存时间更短，提示基因 L0C553103可作为监测胃癌复发转移和预后预测的分子标志。本发明为胃癌的辅助诊断和 预后预测提供了强有力的分子生物学工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
【附图说明】
[0033] 图1为实时巧光定量PCR技术检测BART6-化在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表达 情况，
[0034]BART6-化在鼻咽癌灯）中的表达比正常鼻咽上皮㈱中显著提高（P<0. 001)。
[0035] 图2为原位杂交检测BART6-化在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表达情况， W36]左边为一例鼻咽癌活检标本，BART6-化在癌组织中高表达，而在癌旁(Adjacency)正常鼻咽上皮中低表达；右边为另一例癌旁正常鼻咽上皮标本，BART6-化在 癌旁组织中基本检测不到。
[0037]图3为鼻咽癌及癌旁上皮中BART6-化原位杂交数据的统计结果，
[0038]在40例鼻咽癌癌旁正常上皮（Adjacen巧of NPC)中有34例BART6-化的表达低， 甚至基本检测不到（negative),而在115例鼻咽癌（NPC)中57例检测到有BART6-化的高 表达Oii曲），其余58例为低表达（low)，P<0. 001。
[0039] 图4为BART6-化的表达与鼻咽癌远处转移的相关性， W40] 在115例鼻咽癌标本中，92例发生了复发转移，其中31例为原位复发（local relapse)，61例为远处转移（distanceMetastasis)，从统计结果中可W看出远处转移的患 者中BART6-化高表达的比例更低（P<0. 05)，表明BART6-化的表达与肿瘤复发转移呈负相 关。
[0041] 图5为BART6-化的表达与鼻咽癌患者预后的关系，
[0042] 鼻咽癌中BART6-化的表达与鼻咽癌患者的预后密切相关，即BART6-化高表达 化i曲）的患者生存时间要明显长于BART6-化低表达化OW)的患者任<0.05)。 阳043] 图6为原位杂交检测BART6-化在胃癌及癌旁上皮中的表达情况，
[0044] 左边为一例胃癌活检标本，BART6-化在癌组织中高表达；右边为癌旁正常组织标 本，BART6-化在癌旁组织中基本检测不到。 W45] 图7为BART6-化的表达与胃癌患者预后的关系，
[0046]BART6-化的表达与胃癌患者的预后密切相关，即BART6-化高表达化i曲）的患者 生存时间要明显长于BART6-化低表达化OW)的患者（P= 0. 04)。
[0047] 图8为在邸V阴性的鼻咽癌细胞5-8F、H肥2和胃癌细胞AGS中导入BART6-化寡 核巧酸序列，BART6-化在肿瘤细胞中的表达显著升高， W4引在邸V阴性的鼻咽癌细胞5-8F、H肥2和胃癌细胞AGS中导入BART6-化寡