基于hpv-dna检测与dna甲基化筛查早期宫颈癌的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基于HPV-DNA检测与DNA甲基化筛查早期宫颈癌的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，全球每年新发病例约为528, 000例，死 亡病例约有266, 000例，其中约85 %发生在发展中国家。中国的发病率居高不下，为 7. 5/100, 000,死亡率为3. 4/100, 000。在一些缺乏合理筛查的落后地区，发病率甚至高达 81/100, 000。初步估计，至2030年，每年死于宫颈癌的患者约有474, 000例，其中超过95% 可能发生于落后及发展中国家。因此，寻找宫颈癌早期筛查的有效方法，筛查出宫颈癌前病 变W及肿瘤患者，实施有效的早诊、早治具有重要意义。
[0003]目前，我国采用的是W宫颈液基细胞学为主要内容的宫颈癌筛查策略，同时局部 采用HPV-DNA+细胞学联合筛查。我国尚未建立完善的国家筛查体系，而且由于筛查的 不平衡性（地域经济、医疗资源、公众认知等影响因素），导致目前筛查缺乏与筛查过度 并存、不规范治疗与过度治疗并存。宫颈液基细胞学存在1、单一应用敏感性不高（约为 50% -85% ) ;2、ASCUS及LSIL的特异性不高；3、取材、制片、阅片水平的参差不齐，缺乏规 范化的质量控制等缺陷。因此单一依赖细胞学检查容易造成假阴性，漏检率高。HPV-DNA检 测能够显著提高灵敏度，但往往可能检出一过性HPV感染，而不是具有致病性高危型HPV持 续感染。因此单一依靠HPV筛查，会造成过度诊断和过度治疗。
[0004]DNA甲基化是一个重要的表观遗传学机制。DNA甲基化，即未甲基化胞喀晚-憐 酸-鸟嚷岭（切tosine-phosphate-Guanosine,CpG)二核巧酸发生甲基化，是肿瘤抑制基因 失活的关键机制之一。肿瘤抑制基因（TumorSuppressorGenes,TSG)发生丢失、突变、甲 基化等变化导致正常功能丧失时，细胞的增殖失控形成恶性肿瘤。现已明确DNA甲基化是 TSG失活的S种机制之一，且在某些情况下可能是唯一的机制。因而DNA甲基化在癌症发生 发展中发挥重要作用。作为癌症发生的早期事件，DNA异常甲基化检测可W在患者出现临 床表现或者影像学证据之前做到分子诊断，为癌症早期诊断提供新的途径。
[0005] 国内外研究者利用肿瘤抑制基因甲基化检测，已经在宫颈癌早期筛查的研究中取 得了令人振奋的进步，但是同一基因在不同研究之间存在较大差异，分析其原因可能为：1、 基因甲基化位点的特异性；2、基因遗传背景的差异性；3、操作方法和实验试剂的异质性。 因此，本领域急需进一步发现更有效更稳定更易应用于临床的宫颈癌特异性的甲基化早期 筛查的生物标记物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种基于HPV-DNA检测与DNA甲基化 筛查早期宫颈癌的试剂盒。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种基于HPV-DNA检测与DNA甲基化筛查早期宫颈癌的试剂盒，包括HPV-DNA检 测的试剂，检测基因JAM3-M4甲基化的试剂，所述基因JAM3-M4的序列如SEQIDNo. 1所示。
[0009] 所述HPV-DNA检测是由肥2试剂盒完成。
[0010]所述检测基因JAM3-M4 甲基化包括QlAampDNAMiniKit试剂盒，QIAampEpiTect BisulfiteKits试剂盒。
[0011] 上述的试剂盒，还包括PCR反应液。
[0012] 上述的试剂盒，还包括扩增基因JAM3-M4的正向引物序列如SEQIDNo. 6所示，反 向引物序列如SEQIDNo. 7所示。
[0013] 上述试剂盒，还包括所扩增P-actin的正向引物序列如SEQID No.16所示，反向 引物序列如SEQID No.17所示。
[0014] 上述试剂盒，还包括(1地2〇。
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本申请的发明人经过检索和查阅大量文献W及对化eCancerGenome Atlas(TCGA)平台的数据分析，优选出数个候选基因的多个位点，其中有多个为从未报道过 的位点。通过测定、验证和分析，首次发现JAM3基因的M4位点的甲基化程度与宫颈病变有 关，可作为宫颈癌早期筛查的分子标记。
[0017] 本发明用于宫颈癌早期筛查的试剂盒，检测灵敏性、特异性、阳性预测值及阴性预 测值经临床组织样本的初步W及大量的宫颈脱落细胞学的进一步验证，达到临床诊断的要 求。
[0018]JAM3-M4对于分流高危型HPV阳性的患者W及细胞学筛查结果为ASCUS(特别是小 于30岁的患者）及LSIL患者临床效能高，在分流临床上尚存争议的CIN2方面也有一定的 提示意义。
[0019] 本发明用于宫颈癌早期筛查的分子标记的的引物专一性强，采用本发明的引物进 行扩增时，扩增条件易于摸索，方便进行特异性扩增，优于其他引物。
[0020] JAM3-M4,CADM1-M2,CADM1-M8,DAPK1-M2 或DAPK1-M3,核巧酸序列分别为：
[0026]DNA甲基化及甲基化特异性PCR(MethylationspecificPCR，MS巧的原理：DNA 甲基化即未甲基化胞喀晚-憐酸-鸟嚷岭（切tosine-phosphate-Guanosine,CpG)二核巧 酸发生甲基化，是最常见的一种表观遗传学修饰，主要发生位点是CpG岛。CpG位点在基因 组中出现的频率远低于基因组中其它双核巧酸序列，但在某些区域CpG位点密度很高，可 达均值的5倍W上，形成富含鸟嚷岭和胞喀晚的CpG岛，CpG岛常位于基因的启动子区和 第1外显子区，长约化b。在正常人基因组中，CpG岛外的CpG位点通常是甲基化的，而CpG 岛中的CpG位点通常处于非甲基化状态，运种甲基化的形式在随细胞分裂稳定的遗传。当 肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛W外的CpG位点非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG位点 呈高甲基化状态，导致染色体螺旋程度增加，转录抑制，基因表达缺失。甲基化特异性PCR PCR(MethylationspecificPCR，MS巧是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现 最低约50p曲NA的甲基化，其基本原理为：单链DNA经过亚硫酸氨盐修饰后，所有未甲基化 的胞喀晚（巧tosine，C)脱氨转变为尿喀晚（uracil,U)，而CpG位点中甲基化的胞喀晚保 持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基 化（Meth}dation，M)与非甲基化（Unmeth}dation，U)DNA序列区分开来。
[0027] 本发明的有益效果：
[0028] 本申请的发明人经过检索和查阅大量文献W及对化eCancerGenome Atlas(TCGA)平台的数据分析，优选出数个候选基因的多个位点，其中有多个为从未报道过 的位点。通过测定、验证和分析，首次发现JAM3基因的M4位点的甲基化程度与宫颈病变有 关，可作为宫颈癌早期筛查的分子标记。
[0029] 本发明用于宫颈癌早期筛查的分子标记的的引物及试剂盒，检测灵敏性、特异性、 阳性预测值及阴性预测值经临床组织样本的初步W及大量的宫颈脱落细胞学的进一步验 证，达到临床诊断的要求。
[0030]JAM3-M4对于分流高危型HPV阳性的患者W及细胞学筛查结果为ASCUS(特别是小 于30岁的患者）及LSIL患者临床效能高，在分流临床上尚存争议的CIN2方面也有一定的 提示意义。
[0031] 本发明用于宫颈癌早期筛查的分子标记的的引物专一性强，采用本发明的引物进 行扩增时，扩增条件易于摸索，方便进行特异性扩增，优于其他引物。
【附图说明】
[003引图1为甲基化特异性PCR(MS巧初步检测4个基因的27个位点在宫颈癌组织和正 常对照宫颈组织中甲基化差异性表达水平；
[0033]图 2 为-CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、DAPK1-M3 及JAM3-M4 在早期诊断和筛查 中的应用价值；
[0034] 图3为JAM3-M4在宫颈无瘤变-癌前病变-癌患者脱落细胞的甲基化水平；
[003引图4为R0C曲线分析JAM3-M4甲基化的临床诊断效能；
[0036] 图5为CIN2病例的免疫组化染色及焦憐酸测序。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[003引1、宫颈脱落细胞的DNA提取：
[0039]取患者的宫颈脱落细胞，采用QlAampDNAMiniKit(QiagenGmbH,Germany)试剂 盒提取，最终所得DNA溶液80yL;
[0040] 2、血清游离DM甲基化修饰：
[0041]取 1yg提取的脱落细胞DNA，采用QIAampEpiTectBisyLfiteKits(Qiagen GmbH,Germany)试剂盒修饰，最终所得修饰后DM溶液30yL;
[0042] 3、实时定量甲基化特异性PCR(QMS巧反应体系的构建与优化：
[0043] 1).实时引物序列：
[0044]JAM3-M4 的引物：MF:CGTAGTTAGGGTTGGGATTC(沈QIDNO. 6)
[0045]MR:GAAATCCGACGACTATCCGA(SEQIDNO. 7)，
[0046]P-actin的引物：MF:TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT(SEQIDNO. 16)
[0047]MR:AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(SEQIDNO. 17)
[0048] 2).实时PCR反应体系的优化：
[0049]实时PCR反应套装来自IX化werSY-BR寬GreenPCRMasterMix(ABI,USA)
[0050] 实时PCR反应体系：
[0051] 模板：1yL------修饰后DM;
[005引 引物：1yL-------终浓度为50nM;
[0053] MIX：10yL
[0054] (1地2〇 :8yL
[0055] 对本发明的检测方法的检测灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值及临床标 本检测应用的验证和评估
[0056] 1、所使用的试剂盒为：
[0057] (1)宫颈组织及脱落细胞的DNA提取：QlAampDNAMiniKit(QiagenGmbH,Germa ny)试剂盒；
[0058] (2)DNA甲基化修饰：QlAampEpiTectBisyLfiteKitsQiagenGmbH,Germany) 试剂盒；
[0059] (3)甲基化及非甲基化DNA标准品iEpil'ectPCRControlDNASet伯lA邸N, 5969巧；
[0060] (4)实时PCR反应套装：1X化werSYBR嚴GreenPCRMasterMix(ABI，USA);
[0061] 巧)PCR反应套装：AmpliTaqG、lc!WOMasterMix(ABI，USA);
[0062] 2、实时PCR条件：
[006引实时PCR反应条件：
[0064]
[00财 3、实时PCR结果判断
[006引（1) JAM3-M4甲基化程度的计算公式为2Kt" aetW Wtawet)] X 10, 000 .
[0067] (2)内参P-actin的CT值大于32,认为样本不符合质控，样本不合格；
[006引 做监测SYBRGreenPCR体系的溶解曲线，如果实验样本的溶解溫度与标准品的 溶解溫度偏差± 2°C，则该样本视为无效，需重新检测。
[0069]-、甲基化特异性PCR(MS巧初步检测4个基因的27个位点在宫颈癌组织和正常 对照宫颈组织中甲基化差异性表达水平
[0070] 取2 y g临床组织样本DNA进行甲基化修饰得到反应模板；由图1可W看出，在代 表性的癌和正常宫颈组织中，癌可见明显阳性条带，正常未见明显条带。标准品：M标准品 和U标准品W及未修饰模板验证了引物的特异性。