与猪脂肪沉积性状相关的snp遗传标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪的遗传标记制备技术领域，具体设及一种猪脂肪沉积性状相关的 SNP遗传标记及应用，该遗传标记是从猪ACADL基因中克隆获得。
【背景技术】
[0002] 在猪育种工作中，育种者一直将提高瘦肉率和降低背腰厚作为主要育种目标。虽 然运种选育方式已取得了显著的成效，但是它的遗传选择最终导致肌内脂肪含量的下降， 进而导致猪肉品质的下降。随着消费者对肉质要求的不断提高，改善猪肉品质的遗传研究 已成为畜牧业的研究热点。
[0003] 脂肪沉积性状是猪生产和育种中最为重要的经济性状指标之一。猪皮下脂肪的含 量，如背腰厚度，主要决定禍体品质；而肌内脂肪含量（IM巧主要影响猪肉的嫩度、多汁性 及加工后的风味等肉质特征。猪脂肪沉积受到品种（遗传）和环境两大因素的影响。总 体而言，中国地方猪品种往往具有较强的脂肪沉积能力，表现在猪禍体脂肪含量高、肌内脂 肪含量多，但生长速度缓慢、饲料转化效率低；而国外引进品种由于受到长时间的选育，已 经成功降低了背腰厚度，提高了禍体瘦肉率，但猪肉品质有所下降，比如肌内脂肪含量偏低 (<1.5% )，且易产生劣质的PSE肉（肉色苍白、松软、渗水）。因此，不论国外引进品种还 是中国地方品种，其脂肪沉积性状仍亟需改良。背腰厚（皮下组织脂肪含量）和肌内脂肪 含量是两个具有中等W上强度相关的脂肪沉积性状，单纯从表型上难W将两者分别进行选 择。如果能够鉴别运些基因位点，并辨别出它们影响相关表型程度之间的差异性，则可开发 出用于某一表型特异性选择的分子标记及相应检测技术，准确改良该表型。
[0004] SNP标记指由基因组单核巧酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、 单碱基插入或缺失等。它是基因组中分布最广泛而稳定的点突变，在动植物的基因组中，存 在着大量的SNPs，对于大规模的研究而言，它比微卫星标记和其他的重复序列更可靠，随着 对SNP检测和分析技术进一步发展，尤其是与DNA忍片等技术的结合，它已成继第一代限制 性片段长度多态性标记和第二代微卫星多态性标记之后的第=代新型分子标记。目前，各 国学者在遗传育种方面已展开对SNPs的研究，作为新一代的遗传标记技术，SNPs将在生物 的遗传多样性分析、基因标记、连锁图谱的构建、基因组结构与功能研究、遗传改良和医学 研究等领域发挥巨大作用。其检测方法包括PCR-SSCP、PCR-RFLP、SNP忍片及测序等。
[0005]长链酷基辅酶A脱氨酶（a巧；L-CoAdehy化ogenase，longchainACADL)，是长链 脂肪酸P-氧化起始步骤的催化酶，在长链脂肪酸P-氧化中起着重要作用，其调控机制主 要包括调控表达W及调节其活性。辅酶A参与激活脂肪酸的代谢，脂肪酸的有效代谢可使 机体避免高甘油=醋和高胆固醇造成的健康危害，它具有传递乙酷基的功能，是机体内乙 酷化酶的辅酶，在糖类、蛋白和脂质的代谢中发挥着重要作用。ACADL不足或缺失造成的线 粒体功能素乱会引起肝脏脂肪变性或肝脏膜岛素抗性化ongJi,MarkI.Re化cedCapacity forFattyAcidOxidationinRatswithInheritedSusceptibilitytoDiet-Induced 0besity[J].NIHPublicAccessAuthorManuscript, 2007, 56(8): 1124 - 1130)。蛋白质 相互作用关系的网络分析表明，参与脂肪代谢的ACADL蛋白是肉鸡肝脏代谢反应的关键蛋 白（岳颖.不同基因型肉仔鸡肝脏蛋白组学研究巧]:[硕±学位论文].北京：中国农业 科学院，2013)。瘦蛋白（L巧能刺激脂肪组织分解，它能通过促进ACADL基因的转录和翻 译，对脂肪酸在肝脏中的氧化代谢起到促进作用（张晶.猪脂肪沉积关键基因的初步筛选 扣]:[硕±学位论文].郑州：河南农业大学，2012)。目前，ACADL基因的研究主要集中在 人、小鼠、大鼠和牛等物种，对猪ACADL基因的研究报道较少，申请人对该基因在猪中进行 了多态性研究和关联分析，为猪的遗传改良提供了重要的技术基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于获得与脂肪沉积性状相关的SNP分子标记及应用。从猪ACADL 基因克隆得到一个特异的DM片段，通过寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析 该DNA片段与猪脂肪沉积性状的关系，为猪的标记辅助选择提供一种新的遗传标记。
[0007] 本发明通W下列技术方案实现：
[0008] 申请人通过对猪ACADL基因的分离克隆，发现了一种与猪脂肪沉积性状相关的 SNP分子标记，该标记的核巧酸序列如下所示：
[0010] 上述序列中的第498bp处的W是A或T，508bp处的R是A或G，由于没有引起酶切 位点的改变，所W我们采用直接测序的方法进行检测。 W11] 申请人设计了扩增上述猪ACADL基因片段的引物对（该引物对也是检测本发明的 分子标记的引物对），其DNA序列如下所示： 阳01引 正向引物：5'GTGGAAAATGGAATGAAAG3'，与沈QIDNO: 2所示的序列对应。
[0013] 反向引物：5'CCAATAACCTGATGAGACT3'。与沈QIDN0:3所述的序列对应。
[0014] 本发明建立了一种筛选与猪脂肪沉积性状相关的分子标记的方法，具体步骤如 下：
[0015] 提取猪基因组DNA，根据NCBI中公布的猪ACADL基因序列信息，设计PCR扩增引物 对（该引物的序列如序列表SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示），W大白猪、长白猪和梅山 猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如图3所示的核巧酸序 列（在图3的序列中的W和R显示碱基突变位置，498bp处的W是A或T，508bp处的R是A 或G)，并在大白X梅山F2代群体中进行基因型与猪脂肪沉积性状之间的关联分析检测。
[0016] 本发明为猪脂肪沉积性状的分子标记辅助育种提供了一个新的遗传标记。
[0017] 更详细的技术方案如《【具体实施方式】》所述。
【附图说明】
[0018] 序列表SEQIDNO: 1是克隆的中国地方猪品种"大白猪"的核巧酸序列。序列长 度为69化P，其中在该序列的第498bp处存在一个A/T替换，第508bp出存在一个G/A替换。 (在图5和图6中显示的序列中是已经替换的碱基，突变位点分别是498bp和第508bp)。
[0019] 序列表SEQIDNO: 2和SEQIDNO: 3是本发明设计的引物对的DNA序列。
[0020] 序列表SEQIDN0:4是克隆的中国地方猪猪种"梅山猪"的核巧酸序列。序列长度 为69化P，其中在该序列的第498bp处存在一个T/A替换，第508bp出存在一个A/G替换。。
[0021] 图1 :是本发明的总体技术路线图。
[0022] 图2 :是猪ACADL基因第6内含子的扩增结果。
[0023] 琼脂糖浓度为1. 5%;图中标记说明：泳道M:DL2000Marker;泳道1-3分别为大白 猪、长白猪和梅山猪中的扩增片段，片段大小为69化P。
[0024] 图3 :是猪ACADL基因片段核巧酸序列。图中加粗带框字母W和R代表碱基突变 位置，带下划线序列代表引物位置。 阳0巧]图4 :本发明中检测ACADL基因第6内含子序列突变位点的测序图谱。 阳0%] 图5 :是本发明制备的遗传标记的核巧酸序列（大白猪），序列长度为69化P，其中 在第498bp处存在一个A碱基突变，508bp出存在一个G碱基突变。
[0027] 图6 :是本发明制备的遗传标记的核巧酸序列（梅山猪），序列长度为69化P，其中 在第498bp处存在一个T碱基突变，508bp出存在一个A碱基突变。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1猪ACADL基因片段的获得及多态性检测方法的建立 W29] 1、猪基因组DNA的提取
[0030] 本发明的试验猪品种为大白猪、长白猪（为国外血缘猪品种）、梅山猪（为中国地 方猪血缘品种），样品均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎与分子育种湖北省 重点实验室提供，为常用品种。猪基因组DNA采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基 因组DNA试剂盒（按该试剂盒说明书进行操作）提取，具体步骤如下所述：
[0031] (1)采集20-50mg猪的耳组织，用眼科手术剪剪成糊状后放入2ml的离屯、管中，加 入200y1裂解液化，用枪头吹打均匀。
[0032] (2)加入20y1蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒充分混匀，55°C水浴锅中消化过夜。
[0033] (3)加入200y1结合液CB(该试剂盒自带），充分颠倒混匀，70°C放置lOmin。
[0034] (4)冷却后加入100ii1异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。
[0035] (5)用1血的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000巧m离屯、30s，倒掉收 集管中的废液。
[0036] (6)加入500uL抑制物去除液IR(该试剂盒自带），1200化pm离屯、30s，弃废液。
[0037] (7)加入700y1漂洗液WB，12000巧m离屯、30s，倒掉废液。 阳〇3引 做重复操作步骤（7)。
[0039] (9)将吸附柱AC放回收集管中，12000巧m离屯、2min，尽量去除漂洗液，W免残留的 乙醇抑制下游反应。 W40] (10)取出吸附柱AC，放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位加 50-100y1洗脱缓冲液邸，室溫放置3-5min，12000巧m离屯、Imin，将溶液收集到离屯、管中。
[0041] (11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20°C下保存备用。
[0042] 2、猪ACADL基因片段的获得
[0043] (l)PCR扩增
[0044] 根据ACADL基因的基因组序列（GenBank登陆号：NC_D89478. 1)设计W下引物对：
[0045]正向引物：5 'GTGGAAAATGGAATGAAAG3，，
[0046]反向引物：5，CCAATAACCTGATGAGACT3，。
[0047] 利用上述引物在大白猪、长白猪和梅山猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反 应体系25yL体系中各组分的浓度为lOOng模板DNA、1Xhqbuffer2. 5mmol/X、