一种花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于花生遗传育种领域，具体涉及一种花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法。
【背景技术】
[0002]提高油酸降低亚油酸含量是花生遗传改良研究的重要方向。高油酸花生具有提升花生及其制品的营养价值和延长货架寿命的双重作用，油酸被认为是平衡花生油脂营养及化学稳定性矛盾的首选脂肪酸，培育和种植高油酸花生品种是保障国内花生产业发展、提高花生油营养价值、延长花生制品货架寿命、保护消费者健康需要优先解决的课题。当花生基因组中fad2A基因448bp出现G>A替换和fad2B基因442bp出现A插入时，花生将表现为高油酸；利用连续的回交育种结合分子标记选择的分子育种技术可将现有推广花生品种迅速地改良为高油酸品种，如何快速精准地在回交世代中鉴定出目标基因型的杂交种子作为下一代回交的花粉供体是花生高油酸分子育种的关键环节。
[0003]围绕fad2A基因448bp的G>A替换和fad2B基因442bp的A插入两个突变位点的检测，目前已经建立了至少3种基因型鉴定的方法，如基于Taqman探针的Real-time PCR方法(Barkley，2011)，位点特异性 PCR方法(allele-specific PCR assay, AS-PCR assay)(Chen, 2010)和 CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequence)标记方法等。这些方法都是基于PCR扩增后对特定位点差异设计的检测方法，但在实验的过程中，由于四倍体花生存在的同源非等位基因Fad2A和Fad2B在编码区序列的高度相似性(0RF区均为1140bp，且仅有11个位点的SNP差异)，上述三种方法在设计特异性引物用于单独扩增Fad2A或Fad2B基因序列时可选择的特异性引物结合位点很少，且设计的引物即使扩增成功，往往扩增的效率和特异性都不高，存在较大的假阳性风险。同时，在花生高油酸分子育种中需要进行连续的回交，回交后代基因型的准确鉴定成为高油酸分子育种能否成功的最为关键的技术环节。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种基于PCR产物直接测序技术，用于花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法。
[0005]为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为:
[0006]一种花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法，包括如下步骤:
[0007](I)回交育种后代花生种子子叶薄片样品的获取:用刀片从远胚根端在子叶上切取薄片组织，加入钢珠、液氮冷冻后，立即研磨得到花生种子子叶薄片样品；
[0008](2)花生种子子叶薄片样品的DNA提取；采用CTAB法提取花生种子子叶薄片样品的基因组DNA ；
[0009](3)以提取的基因组DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述特异性引物的引物序列为:F0.7:5-CACTAAGATTGAAGCTC-3 ；R3:5-CCCTGGTGGATTGTTCA-3 ；
[0010](4)以R3:5-CCCTGGTGGATTGTTCA-3为测序引物，对PCR扩增产物进行测序；
[0011](5)根据测序峰图判定回交育种后代花生种子的基因型。
[0012]上述方案中，所述根据测序峰图判定回交育种后代花生种子的基因型的具体判定方法为:(I)首先确认测序峰图上，在Fad2A和Fad2B基因之间的SNP位点0RF432bp产生C/A套峰、在Fad2A和Fad2B基因之间的SNP位点0RF465bp产生A/G套峰、在Fad2A和Fad2B基因之间的SNP位点0RF528bp产生C/T套峰、或在Fad2A和Fad2B基因之间的SNP位点0RF534bp产生C/T套峰，来确认扩增产物中同时存在Fad2A基因和Fad2B基因的序列产物；(2)然后根据测序峰图，在Fad2A/2a基因的SNP位点0RF448bp上，若存在G/A套峰，基因型判定为Aa，若不存在G/A套峰则基因型判定为AA ;在Fad2B/2b基因的SNP位点0RF442bp上，若存在A插入引起的测序迭峰，基因型判定为Bb，若不存在A插入引起的迭峰则基因型判定为BB ; (3)根据步骤(2)的判断结果，最终判定回交育种后代花生种子的基因型为 AABB、AABb、AABB 或 AaBb。
[0013]上述方案中，所述CTAB法提取花生种子子叶薄片样品基因组DNA的具体操作步骤为:(I)在花生种子子叶薄片样品中加入400 μ L CTAB提取缓冲液，在55?65°C水浴锅中水浴20-30min ；⑵加入200 μ L苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的混合溶液，充分振荡混匀后室温静置1min ; (3) 12000rpm离心lOmin，离心后取上清液，加入等体积氯仿:异戊醇=24:1的混合溶液，振荡混匀后12000rpm离心lOmin，取上清液再加入等体积异丙醇或2.5倍体积无水乙醇，_20°C静置30min以完全沉淀DNA ；⑷12000rpm离心30min后弃上清，白色沉淀用75%酒精洗2-3遍；在超净工作台上风干残留的酒精，白色沉淀用50-100 μ L1*TE或蒸馏水溶解。
[0014]上述方案中，所述PCR扩增反应的反应体系为:50 μ L的反应体系含模板DNA(约15ng μ L:) 5 μ Ln 弓I 物(4pmol μ L 3 5 μ L，10* 缓冲液(25mmol L 3 5 μ L、MgCl2 (25mmolL 4 μ L^dNTP (2.5mmolL 1.0 μ L、Taq DNA 聚合酶(5UyL ^0.5 μ L、灭菌双蒸水 29.5 yL ；所述PCR扩增反应的PCR循环反应参数为:94°C 5min ；94°C 45s, 55°C lmin，72°C 90s，32个循环；72°C 5min。
[0015]本发明所述鉴定方法利用的基本原理是:创新性地利用花生fad2A和fad2B基因序列的高度相似性，以及高油酸突变的SNP位点分别位于Fad2B基因的0RF442和Fad2A基因的0RF448bp的临近区段，设计一对特异性强、易于扩增的PCR引物，利用一个PCR反应同时扩增出Fad2A和Fad2B基因的片段，并通过PCR产物直接测序的方法，区分花生高油酸回交后代中的4种基因型。本发明选择基因型为AaBb的双杂合种子作为下一代回交的花粉供体。
[0016]本发明的有益效果如下:本发明所述花生高油酸回交育种后代基因型的快速精准鉴定方法具有试验技术要求低、操作程序和所需设备简单、结果精准可靠等特点，非常适用于花生高油酸回交育种后代中基因型的快速精准鉴定，采用本发明所述鉴定方法可以准确的判定回交育种后代的基因型，为正确选择双杂合基因型(AaBb)的种子作为下一代回交的花粉供体提供了有力的技术支持。
【附图说明】
[0017]图1为花生Fad2A/2a基因和Fad2B/2b基因的序列差异。
[0018]图2为基因型为AABB的花生高油酸回交育种后代的测序峰图。
[0019]图3为基因型为AABb的花生高油酸回交育种后代的测序峰图。
[0020]图4为基因型为AaBB的花生高油酸回交育种后代的测序峰图。
[0021]图5为基因型为AaBb的花生高油酸回交育种后代的测序峰图。
【具体实施方式】
[0022]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0023]图1为花生Fad2A/2a基因和Fad2B/2b基因的序列差异。图中总计有6个SNP位点，其中第一个SNP位点为非等位基因Fad2A基因/Fad2B基因S 0RF432bp之间的C/A差异；第二个SNP位点为等位Fad2B/2b基因0RF442bp之间的A插入差异；第三个SNP位点为等位Fad2A/2a基因0RF448bp之间的G/A差异；第4_6个SNP位点为非等位基因Fad2A/Fad2B基因0RF465、528、534bp之间的A/G、C/T、C/T差异。以下实施例中，以第一个SNP位点(非等位基因Fad2A基因/Fad2B基因0RF432bp之间的C/A差异)是否产生C/A套峰来确认扩增产物中是否同时存在Fad2A和Fad2B的序列产物。本发明也可采用第4个SNP位点(非等位基因Fad2A/Fad2B基因0RF465bp之间的A/G差异)是否产生A/G套峰来确认扩增产物中是否同时存在Fad2A和Fad2B的序列产物、第5个SNP位点(非等位基因Fad2A/Fad2B基因0RF528bp之间的C/T差异)是否产生C/T套峰来确认扩增产物中是否同时存在Fad2A和Fad2B的序列产物、或者第6个SNP位点(非等位基因Fad2A/Fad2B基因0RF534bp之间的C/T差异)是否产生C/T套峰来确认扩增产物中是否同时存在Fad2A和Fad2B的序列产物。
[0024]实施例1
[0025]一种