一种用于鉴定蛤蚧的pcr方法及其特异引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材鉴定领域，设及一种用于鉴定始阶的PCR方法及其特异引物。
【背景技术】
[0002] 始阶为壁虎科动物始阶Ge化0geckoLinnaeus的干燥全体，收载于2010年及即 将实施的2015年版《中国药典》。始阶具有补肺益肾，纳气定喘，助阳益精的功效，在临床上 主要用于肺肾不足，虚喘气促，劳嗽咳血，阳瘦，遗精等。
[0003] W始阶为主要原料的中成药，如始阶精、始阶补肾丸、始阶定喘丸等应用广泛，用 量甚大。当前国内大壁虎的数量已急剧减少，几近枯竭，早在1989年1月，林业部与农业部 联合颁布《国家重点保护野生动物名录》中，就已将始阶列为国家II级保护动物。近年来 随着始阶资源的缩减，已有始阶的伪品出现。据文献资料，市场上出现过的始阶伪品多达18 种，包括东方蝶顺、中国療顺、变色树姗、无樸壁虎、多痛壁虎、红螺痛顺、喜山岩姗、青海沙 财斤、石龙子、变色沙姗等。市场中也存在始阶的伪品，Liu等使用分子检测技术对9批始阶 样品进行分析，发现只有3批为正品始阶。对其中一些品种，始阶正品与之形态学特征差别 细微，传统的鉴别方法很难对始阶药材进行鉴定。尤其是经过炮制加工、运输储藏后，甚至 切片分类后，市场流通的商品始阶形态有所改变，始阶及其混伪品的性状特征消失，难W区 分。
[0004] 此外，也有研究表明可采用DNA测序技术进行鉴别，但DNA测序技术鉴别结果不够 直观，操作略显复杂，不能满足快速鉴别的需求。为确保药材市场中始阶的质量及其临床疗 效，需要建立快速、准确、科学性强、使用方便的方法进行鉴定。
【发明内容】
阳〇化]本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定中药始阶的引物对。
[0006] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药始阶的引物对，具体为如下（a)或化） 所示的引物对：
[0007] (a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
[0008] 化）由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/ 或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与（a)中所述引物对功能相同的引 物对。
[0009] 所述引物对中，两条单链DNA分子既可W分别单独包装，也可W按照摩尔比为1:1 的比例混合后包装在一起。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定中药始阶的试剂盒。
[0011] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药始阶的试剂盒，具体可含有所述引物 对、dNTP和DNA聚合酶。
[0012] 根据需要，所述试剂盒中还可含有巧光染料SYBRGreenI。
[0013]制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。
[0014] 制备所述引物对的方法，具体可包括将组成所述引物对的两条单链DM分子分别 单独包装的步骤。
[0015] 制备所述试剂盒的方法也属于本发明的保护范围。
[0016] 制备所述试剂盒的方法，具体可包括如下A)或B)的步骤：
[0017] A)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的 dNTP和DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内：
[0018]B)将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的 dNTP、DNA聚合酶和SYBRGreenI包装于同一个试剂盒内。
[0019] 所述引物对或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定中药始阶中的应用也属于本发明的 保护范围。
[0020] 本发明的第=个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测中药样品中是否含有中药始阶的方法。
[0021] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品中 是否含有中药始阶的方法，具体可包括如下步骤： 阳0巧 （a)从待测中药样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对（序列1和序列 2)进行PCR扩增； 阳〇2引化）为如下化1)或化。：
[0024]化1)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测中药样品中是否 含有中药始阶：若PCR产物中含有250-5(K)bp(如400-45化P)的DNA片段，则所述待测中药 样品中含有或候选含有中药始阶；若PCR产物中不含有250-5(K)bp(如400-45化P)的DNA 片段，则所述待测中药样品中不含有或候选不含有中药始阶； 阳02引 化。向步骤（a)扩增后的反应体系中加入巧光染料SYBRGreenI，得到含有巧光 染料的体系，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药始阶：若观察到所述含有巧 光染料的体系产生绿色巧光，则所述待测中药样品中含有或候选含有中药始阶；若观察不 到所述含有巧光染料的体系产生绿色巧光，则所述待测中药样品不含有或候选不含有中药 始阶。
[00%] 本发明的第四个目的是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定 待测中药样品为始阶正品还是始阶伪品的方法。
[0027] 本发明所提供的利用所述引物对或所述试剂盒鉴定或辅助鉴定待测中药样品为 始阶正品还是始阶伪品的方法，具体可包括如下步骤：
[00測 （a)从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用所述引物对（序列1和序列2) 进行PCR扩增；
[0029] 化）为如下化1)或化。：
[0030] 化1)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测中药样品为 始阶正品还是始阶伪品：若PCR产物中含有250-50化P(如400-45化P)的DNA片段，则所述 待测中药样品为或候选为始阶正品；若PCR产物中不含有250-50化P(如400-45化P)的DNA 片段，则所述待测中药样品为或候选为始阶伪品； 阳03U 化。向步骤（a)扩增后的反应体系中加入巧光染料SYBR Green I，按照如下方法 确定待测中药样品为始阶正品还是始阶伪品：若观察到所述反应体系产生绿色巧光，则所 述待测中药样品为或候选为始阶正品；若观察不到所述反应体系产生绿色巧光，则所述待 测中药样品为或候选为始阶伪品；
[0032] 所述待测中药样品为始阶正品或始阶伪品；所述始阶正品为中药始阶；所述始阶 伪品选自变色树姗、变色沙姗、丽斑麻姗、红螺痛顺、中国石龙子和无樸壁虎的任一种或任 几种。 W33] 在上述两种方法的步骤（a)中，进行所述PCR扩增时采用的退火溫度可为 60-68°C(如 65°C)。
[0034] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应条件如下：95°CImin;95°C5s、 65°C5s，30 个循环。
[0035] 在所述方法的步骤（a)中，在进行所述PCR扩增的反应体系中，所述引物对中每条 单链DNA分子的终浓度均为80nmol/L。
[0036] 在本发明中，进行所述PCR扩增时采用的具体反应体系如下：10XPCR缓冲液 2. 5yLdNTP(2. 5mmol ?Li)lyLl'aq DNA聚合酶（抓吃1)0. 2yL和模板DNA lyL(30ng)， 上下游鉴别引物（lOymol -Li)各0.2yL灭菌蒸馈水补足至25yL。 W37] 在实际应用中，判断所述PCR产物中是否含有250-50化P(如400-45化P)的DNA片段，可通过将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行检测，若电泳结果显示有 250-500bp(如400-450bp)目的条带，则所述PCR产物中含有250-500bp(如400-450bp)的 DNA片段；反之，则不含有250-50化P(如400-45化P)的DNA片段。当然也通过测序的方法 判定所述PCR产物中是否含有250-50化P(如400-45化P)的DNA片段。
[0038] 在上述两种方法的步骤化2)中，