系和反应条件同实施例1 步骤=1。实验同时设置W水替代模板的空白对照，W中国食品药品检定研究院提供的中药 始阶作为阳性对照品。实验重复=次。
[0078] 反应结束后，一方面，按照实施例1中步骤=2 (1)的方法对待测样品进行鉴定。另 一方面，按照实施例1中步骤=2 (2)的方法对待测样品进行鉴定。
[0079] 结果显示，利用本发明的引物对（引物GeJie-1和GeJie-2)对表1中所有的78 个已知始阶类中药样品进行检测，始阶都能够扩增出片段大小约为41^p的目的条带（测 序后序列正为序列表中序列3)。而始阶外的其他样品均未扩增出4^bp目的条带。图1、 图2为部分始阶类样品的特异性PCR产物凝胶电泳结果。另外，巧光检测结果表明，始阶均 显示出明亮绿色巧光，而始阶外的其他样品均不发绿色巧光。图3为部分始阶类样品的特 异性PCR巧光检测结果。可见，采用本发明的引物对（引物GeJie-1和GeJie-2)鉴定中药 始阶，可通过巧光染色的方法对结果进行直接判定，操作简便，且检测准确率高达100 %。
[0080] 实施例3、采用实施例1制备的试剂盒鉴定中药始阶的灵敏度分析
[0081] 待测样品：中药始阶（毫州）。符合中国药典（2010年版）一部正文各药材项下 的有关规定。通过鉴定，药材实物与名称相符，质量符合标准。
[0082] 对照样品：变色树姗；变色沙姗；丽斑麻姗；红螺痛顺；中国石龙子；无樸壁虎符 合中国药典（2010年版）一部正文各药材项下的有关规定。通过鉴定，药材实物与名称相 符，质量符合标准。 阳08引一、从待测样品中提取基因组DNA
[0084] 分别取约50mg干燥样品，用CTAB法提取总DNA。具体参照实施例2步骤一进行。 阳0化]二、PCR扩增
[0086] 将步骤一从中药始阶和其他对照样品中分别提取的基因组DNA进行倍比稀释，得 到基因组DNA模板浓度分别为l(K)ng/yl、20ng/yl、4ng/y1、Ing/y1的系列稀释液，W各 稀释液分别为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（引物GeJie-1和GeJie-2)进行 PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤S1。实验同时设置W双蒸水为模 板作为阴性对照。实验重复=次。
[0087] 反应结束后，按照实施例1中步骤=2的方法对待测样品和对照样品进行鉴定。 阳08引结果如图4所示，从图中可W看出：
[0089]利用本发明的引物对（引物GeJie-1和GeJie-2)对中药始阶进行检测，当模板浓 度为4ng/y1时仍能够检测到大小约为4^bp的目的条带。将大小约为4^bp的目的条带 回收测序，其序列正为序列表中序列3。而对其他对照样品的均为检测到大小约为412bp的 目的条带。
【主权项】
1. 用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对，为如下（a)或（b)所示的引物对： (a) 由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对； (b) 由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添 加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与（a)中所述引物对功能相同的引物对。2. 用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求 1所述的引物对、dNTP和DNA聚合酶。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有荧光染料SYBR Green1〇4. 制备权利要求1所述引物对的方法，包括将组成所述引物对的两条单链DNA分子分 别单独包装的步骤。5. 制备权利要求2或3所述试剂盒的方法，包括如下A)或B)的步骤： A) 将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP和 DNA聚合酶包装于同一个试剂盒内： B) 将组成所述引物对的两条单链DNA分子分别单独包装后，与分别单独包装的dNTP、 DNA聚合酶和SYBRGreenI包装于同一个试剂盒内。6. 权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定中药蛤 蚧中的应用。7. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测 中药样品中是否含有中药蛤蚧的方法，包括如下步骤： (a) 从待测中药样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行 PCR扩增； (b) 为如下（bl)或（b2): (bl)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有 中药蛤蚧：若PCR产物中含有250-500bp的DNA片段，则所述待测中药样品中含有或候选含 有中药蛤蚧；若PCR产物中不含有250-500bp的DNA片段，则所述待测中药样品中不含有或 候选不含有中药蛤蚧； (b2)向步骤（a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，得到含有荧光染 料的体系，按照如下方法确定待测中药样品中是否含有中药蛤蚧：若观察到所述含有荧光 染料的体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品中含有或候选含有中药蛤蚧；若观察不到 所述含有荧光染料的体系产生绿色荧光，则所述待测中药样品不含有或候选不含有中药蛤 蚧。8. 利用权利要求1所述的引物对或权利要求2或3所述的试剂盒鉴定或辅助鉴定待测 中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品的方法，包括如下步骤： (a) 从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩 增； (b) 为如下（bl)或（b2): (bl)根据步骤（a)所得PCR产物的大小，按照如下方法确定所述待测中药样品为蛤蚧 正品还是蛤蚧伪品：若PCR产物中含有250-500bp的DNA片段，则所述待测中药样品为或候 选为蛤蚧正品；若PCR产物中不含有250-500bp的DNA片段，则所述待测中药样品为或候选 为始蚁伪品； (b2)向步骤（a)扩增后的反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，按照如下方法确定 待测中药样品为蛤蚧正品还是蛤蚧伪品：若观察到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待 测中药样品为或候选为蛤蚧正品；若观察不到所述反应体系产生绿色荧光，则所述待测中 药样品为或候选为蛤蚧伪品； 所述待测中药样品为蛤蚧正品或蛤蚧伪品；所述蛤蚧正品为中药蛤蚧；所述蛤蚧伪品 选自变色树蜥、变色沙蜥、丽斑麻蜥、红螺疣螈、中国石龙子和无蹼壁虎的任一种或任几种。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：在步骤（a)中，进行所述PCR扩增时 采用的退火温度为60-68°C;或 在步骤（b2)中，确定所述含有荧光染料的体系是否产生绿色荧光是在365nm紫外波长 下进行检测的。10. 根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述250-500bp的DNA片段为 412bp的DNA片段； 所述412bp的DNA片段具体为序列表中序列3所示的DNA片段。
【专利摘要】本发明公开了一种用于鉴定蛤蚧的PCR方法及其特异引物。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定中药蛤蚧的引物对，具体为如下(a)或(b)所示的引物对：(a)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(b)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。本发明通过分析蛤蚧与其混伪品的细胞色素c氧化酶I基因序列，获得蛤蚧高特异性区域，设计鉴别引物，采用特异性PCR技术实现了蛤蚧及其混伪品的准确鉴别，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105200140
【申请号】CN201510662612
【发明人】黄璐琦, 袁媛, 蒋超, 赵玉洋
【申请人】中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月14日