裸鼹鼠vegfa基因特异性检测引物及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体设及裸廳鼠VEGFA基因检测技术。
【背景技术】
[0002] 裸廳鼠是一种长期生活于与外界气体交换不顺杨、空气中的二氧化碳浓度极高， 而氧气含量极低（10%~15%)的桐穴环境中的晒齿类哺乳动物。所W其具有极强的耐受 低氧环境的能力，是研究耐低氧机制的良好动物模型。研究表明，肿瘤局部缺血缺氧微环境 在肿瘤的发生、发展W及治疗抵抗中具有重要作用。局部低氧微环境是实体肿瘤的基本特 征之一，低氧微环境不仅是肿瘤发生恶性转化的始动因素，其还可W诱导肿瘤细胞对放射 化疗的抵抗。所W对裸廳鼠进行耐低氧机制的研究对于解决肿瘤治疗过程中出现的放疗抵 抗具有重要意义。研究发现，无论是在个体发育的过程还是在低氧环境应激的过程中，血 管的生成严格地依赖于血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF) (人的VEGFA的GeneID:7422,小鼠的VEGFA的GeneID:22339)。本发明人所在的实验 室前期的研究也发现，在常氧条件下，成年裸廳鼠组织（脑、肺、屯、、肝、肾、肌肉）中VEGFA mRNA(Gene10:101702403)水平是成年小鼠的几百倍，从而提示该基因的组成型高表达可 能在裸廳鼠适应低氧环境中发挥重要作用。所W对裸廳鼠VEGF基因表达水平的检测有利 于掲示其可能存在的耐低氧机制。
[0003] 目前，由于裸廳鼠繁殖周期长（雌性裸廳鼠性成熟年龄228天、雄性裸廳鼠性成熟 年龄12个月（分别是小鼠的6. 5倍和8. 1倍）），裸廳鼠的妊娠期（68天）是小鼠（21天） 的3. 2倍），而且裸廳鼠属于真社会性生活哺乳动物，在一个群体中只有"女王"雌性裸廳鼠 具有繁殖的机会。并且，野生裸廳鼠生活于东非埃塞俄比亚、肯尼亚和索马里热带草原的干 旱地区，难于捕获。所有的运些原因均造成裸廳鼠来源数量相对较少，极大地制约了其应用 研究。而体细胞培养技术可W很好地解决研究材料来源困难的问题。体外培养细胞具有较 强的分裂、增殖能力，适应性强，易培养，性状稳定等特点，广泛地运用于当前的研究当中。
[0004] 目前，在科学研究当中对VEGFA基因表达的检测主要是通过westernblotting 和化ISA检测试剂盒进行基因蛋白表达水平的检测巧isenachPA，etal. (2010)MT1-MMP regulatesVEGF-AexpressionthroughacomplexwithVEGFR-2andSrc.JCell Sci. 123(Pt23) : 4182-4193.)但是本方法中需要应用特异性的抗体，而目前没有针对于 裸廳鼠的特定抗体，使用针对其他物种（小鼠、家兔、人类）的抗体存在结合力不足问题， 而且某些类型细胞（如皮肤成纤维细胞、肝星形细胞）中VEGFA蛋白表达量较低，western blotting检测容易检测不到，而且结果不稳定（见图1)。另外，在Real-timePCR检测mRNA 表达的过程中，由于设计引物的特异性存在很大差异，从而导致PCR反应容易产生非特异 性片段或引物二聚体，即反应的溶解度曲线出现多个峰现象（见图4)。
[0005] 目前尚无文献报道设及裸廳鼠VEGFA基因的特异性检测引物和检测试剂盒。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述检测技术的不足，本发明提供了VEGFA基因Real-timePCR检测的 引物及检测试剂盒。
[0007] 本发明的第一方面，提供一种裸廳鼠VEGFA基因特异性检测引物，VEGFA基因 Real-timePCR检测引物（20D)为：
[0008]正向引物：5'-TGCCCTTGGTGGGGTTTG-3'（沈QIDN0:1)，
[0009]反向引物：5'-CGAGACGCTGGTGGACATC-3'（沈QIDN0:2)。
[0010] 本发明的第二方面，提供一种裸廳鼠VEGFA基因的检测试剂盒，包括VEGFA基因 Real-timePCR检测引物（20D):
[0011] 正向引物：如沈QIDNO: 1所示，
[001引反向引物：如沈QIDN0:2所示。
[0013] 上述裸廳鼠VEGFA基因特异性检测试剂盒，还包括：
[0014] 2XSYBR愈PremixExhgTySOOC)y1，R0XReferenceDye(50X) 200y1。
[0015] 较佳的，本发明所述的一种裸廳鼠VEGFA基因的检测试剂盒，包括：
[001引正向引物：如沈QIDN0:1所示，20D;
[0017]反向引物：如沈QIDNO: 2所示，20D;
[001 引.2乂SY技孜麼PremixExTaq?，5000y1 ;
[0019]ROXReferenceDye(50X),200y1；
[0020] 灭菌蒸馈水适量（优选5000y1，每个试剂盒可W做1000次PCR反应）。
[0021] 本发明的第S方面提供一种裸廳鼠VEGFA基因的检测方法，所述的检测方法利用 上述特异性检测引物；或利用上述检测试剂盒，所述的检测方法包括如下步骤：
[0022] 提取细胞的总mRNA，然后反转录成cDNA，W此cDNA为模板，利用VEGFA基因的 Real-timePCR检测引物进行巧光定量PCR反应，引物序列如下：
[0023]正向引物：5, -TGCCCTTGGTGGGGTTTG-3'（沈QIDN0:1);
[0024]反向引物：5'-CGAGACGCTGGTGGACATC-3'（沈QIDN0:2)。
[0025] 上述裸廳鼠VEGFA基因特异性检测的方法，具体检测步骤为：
[0026] 1)提取细胞或者组织中总RNA:
[0027] 采用TRIZ化法提取细胞或组织中总RNA，并采用反转录试剂盒反转录为cDNA(反 转录试剂盒，天根生化科技公司）
[0028] 2)制备Real-timePCR检测反应体系 10y1:
[002引 将步骤1)中cDNA溶液稀释10倍后取1y1，2XSYBR饭PremixEx化9"5y1， PCR正向引物（PCR化rwardprimer)稀释为10yM浓度后取0.2yl，PCR反向引物（PCR reverseprimer)稀释为 10uM浓度后取 0.2yl，ROXReferenceDye(50X) 0.2yl，灭菌 蒸馈水3.4yl。设置阴性对照。
[0030] 3)进行PCR反应，反应程序如下：
[0031]保溫阶段（Holdingstage)95°C30s;循环阶段（^cyclingstage)95°C5s， 60°[；343,72°[303,40个循环；溶解曲线阶段（]\1611:州1'￥6 31曰邑6)95°[153,60°[1111；[]1， 95°C15s〇
[0032] 所述TRIZ化法为：取常氧条件（20% 〇2、5 %C〇2)培养的裸廳鼠皮肤成纤维细胞 样本3份，标记为1、2、3,取低氧培养条件（3% 02、92%成、5%C〇2)培养的裸廳鼠皮肤成 纤维细胞样本 3 份，标记为 4、5、6。（可参见QiomczynskiP(1993)Areagentforthe single-stepsimultaneousisolationofRNA,DNAandproteinsfromcellandtissue samples.Biotechniques15:532-534, 536-537.)
[0033] 本发明的技术效果如下：
[0034] 所用的引物针对VEGFA的mRNA水平进行检测，提取裸廳鼠细胞的总mRNA，并反转 录为cDNA作为检测样品，运用Real-timePCR方法进行检测，得出VEGFA的mRNA表达水平， 利用Real-timePCR检测技术能特异性地定量和定性监测VEGFA基因mRNA表达水平的动 态变化，简单快捷，适合推广使用。作为判断裸廳鼠VEGFA基因表达发生改变的判断依据， 具有良好的特异性和实用性。
【附图说明】
[0035] 图1为使用抗小鼠VEGFA抗体，Westernblot检测裸廳鼠皮肤成纤维细胞中VEGFA 蛋白表达效果图（其中样本1为常氧条件下（〇2体积分数20% )细胞蛋白样品，设置两个 重复，样本2为低氧条件下（〇2体积分数3%)的细胞蛋白样品，设置两个重复）；
[0036] 图2为实施例1的Real-timePCR检测的溶解度曲线；
[0037] 图3为实施例1的Real-timePCR检测的扩增曲线。
[003引图4为实施例2中另外立对引物（a、b、c)和本发明中的引物序列（SEQIDN0:1、 沈QIDN0:2)(d)Real-timePCR检测的溶解度曲线。
【具体实施方式】
[0039]W下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步的说明。
[0040] 实施例1 :
[0041] 提取细胞的总mRNA,然后反转录成cDNA，W此cDNA为模板，应用VEGFA基因的 Real-timePCR检测引物及试剂盒，引