小麦条锈菌的定量检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种小麦条诱菌的定量检测试剂盒及其应 用。
【背景技术】
[0002] 小麦条诱病的早期监测与定量分析一直是该病害治理的重要环节之一。特别是在 小麦苗期条诱病处于潜育阶段时，建立快速、准确的测定方法，对该病害的预测预报和防 治具有重要的意义。可W在病害的潜育期尽早确定和预测病害的发生程度，并在病害未大 面积流行前，通过快速、准确的早期监测及时制定药剂防治措施W降低初始菌源量，抑制或 减慢病害的发展。
[0003] 长期W来，现有的监测方法，如人工调查、叶片培养、遥感监测等尚不能实现对病 原菌侵染后小麦叶片处于潜育状态时侵染程度的准确、快速的定量分析。近年来，分子生 物学技术的发展使得对病害的快速检测成为可能，并开始应用于小麦条诱病的早期检测。 Zhao等、Cao等设计小麦条诱菌的特异性引物，利用普通PCR方法实现了对条诱病的分子 检测。此后，Wang等建立了PCR方法检测侵入小麦叶片中的条诱菌的方法，Wang等进一步 发展了巢式PCR的检测方法。Real-timePCR是近些年来发展起来的可W定量检测植物病 原菌的方法。Winton等利用巧光Real-timePCR在一管中同时检测到多种病原菌。另外， Gachon等、Bohm等、Mercado-Bianco等都利用相同的方法实现了对病原菌在寄主植物内动 态变化的追踪。化aaije等利用Real-timePCR开展了小麦条诱菌的研究工作，不过引物最 低可检测的病原菌量仅为40pg。
[0004] 目前国内外开展了一些对小麦条诱病病原菌的定性检测研究，尚未见小麦条诱病 早期定量监测方法的报道。
【发明内容】
阳0化]本研究通过比较普通PCR和Real-timePCR方法在早期检测小麦条诱病方面的优 缺点，建立SYBRGreenI方法，W定量测定小麦条诱病菌在潜育状态下的侵染量，为该病害 的早期预测和防治决策提供依据。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 用于定量检测小麦条诱菌的试剂盒，包括巧光定量PCR扩增的常规试剂，其特征 在于，还包括检测条诱菌的引物；所述引物的正向和反向的核巧酸序列如下：
[0008] osgQ607/osgQ608 ：
[0009] GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。
[0010] 所述巧光定量PCR扩增的常规试剂包括：2XSGPCRMasterMix和/或2XSG GreenqPCRMix,W及双蒸水。
[0011] 一种定量检测小麦条诱菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0012] (1)获取标准曲线方程：
[0013] 所述标准曲线方程是W系列DM标准品的梯度拷贝数浓度为横坐标，w采用引物 osgQ607/osgQ608对所述系列DNA标准品分别进行巧光定量PCR扩增所得的Ct值为纵坐标 绘制的标准曲线拟合得出的方程；
[0014] (2)采用引物osgQ607/osgQ608对提取自待测样品的曲NA进行巧光定量PCR扩 增；
[0015] (3)收集待测样品DNA的巧光定量PCR扩增的巧光信号，根据所述阔值确定待测样 品DNA的Ct值；
[0016] (4)将待测样品DNA的Ct值代入标准曲线获得待测样品DNA的拷贝数浓度；
[0017] 所述DNA标准品为条诱菌曲NA的普通PCR扩增产物；所述待测样品为 小麦曲NA;所述引物osgQ607/osgQ608 的序列如下：GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/ TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。
[0018] 所述巧光定量PCR扩增的反应体系为：2XSG Green qPCRMix:0. 5yl/yl，所述 引物正向和反向各为：〇. 25iiM，DNA模板：0.05^1/^1，其余为双蒸水。
[0019] 所述巧光定量PCR扩增的反应程序为：95°C预变性10分钟；95°C变性20秒，60°C 退火延伸30秒，45个循环。 W20] 所述DNA模板为曲NA或W曲NA为模板的普通PCR扩增产物。
[0021] 所述普通PCR扩增是指W曲NA为模板，用所述引物osgQ607/osgQ608进行的普通 PCR扩增反应；所述普通PCR扩增的反应体系为：2XSGPCRMasterMix:0. 5y1/y1，所述 引物正向和反向各为：〇. 25iiM，普通PCR扩增产物：0.05^1/^1，其余为双蒸水；反应程序 为：94°C预变性10分钟；94°C变性20秒，60°C退火延伸30秒，40个循环。
[0022] 本研究义用"GlassandDonaldson, 1995."报道的真菌保守基因引物E5t2a/Bt2b， 其核巧酸序列为：5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3' /5'ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。 W小麦条诱菌、小麦叶诱菌、小麦杆诱菌等病原菌的基因组DNA为模板，进行PCR比较扩增。 扩增及测序结果显示，该引物在小麦条诱菌的DNA中扩增出36化P长度的片段，在小麦叶诱 菌、小麦杆诱菌的DNA中扩增出的条带都是49化P，具体见图6, 7, 8。为了获得能够特异地 将条诱菌从叶诱、杆诱菌及其它类似麦类病原真菌中鉴别出来，需要进一步设计特异引物。
[0023] 本发明根据小麦条诱菌（Pucciniastrii化rmis)的特异性片段362bp大小的 基因序列设计对该病原菌种具有特异性的引物0SgQ607/〇SgQ608，并分别在普通PCR和 Real-timePCR扩增时对该引物的特异性和灵敏性进行了测定。结果表明该引物对小麦条 诱菌特异性高，可稳定扩增出82bp的目标条带。应用此特异性引物，建立了Real-timePCR 测定系统，定量测定了条诱菌在小麦叶片接种后组织内的DM随时间的变化。利用本发明 所述试剂盒中的所述引物，普通PCR和Real-timePCR扩增的最低检出限分别为lOpg和 Ifg。Real-timePCR的灵敏度为普通PCR的100倍。本发明还建立了Real-timePCR标准 曲线，用于定量测定侵染在小麦叶片内条诱病病原菌的DNA。本发明基于AB口500巧光定量 扩增仪，优化Real-TimePCR反应体系，成功地建立SYBRGreenI巧光染料法定量PCR检 测体系。
[0024] 本发明所设计的引物与目前应用于条诱病分子检测的其他引物相比，更适用于 Real-timePCR的检测。本发明中目标菌在Real-timePCR的溶解曲线中显示为单一产物 峰，无引物二聚体等非特异性带干扰。在设计筛选引物的过程中发现，扩增片段过长的引物 虽然在普通PCR检测中表现特异性，扩增产物为单一片段，但在Real-timePCR检测上可能 并不表现为单一产物；而本发明所选择的引物，消除了其他引物在Real-time检测上的缺 点。
[00巧]本发明提供的试剂盒和方法能相对准确地定量测定小麦条诱菌在潜育状态下的 侵染量，具有检出限低、灵敏度好、特异性强、扩增效率高等特点，为早期预测和防治小麦条 诱病提供了一种可靠的检测手段。
【附图说明】
[0026] 图1是W梯度浓度的条诱菌曲NA的普通PCR扩增产物作为系列DNA标准品为模 板，采用本发明所述试剂盒进行巧光定量PCR扩增获得的扩增曲线图及阔值。
[0027] 图2是W梯度浓度的条诱菌曲NA的普通PCR扩增的产物作为系列DNA标准品为 模板，采用本发明所述试剂盒进行巧光定量PCR扩增获得的烙解曲线图。
[0028] 图3是W梯度浓度的条诱菌曲NA的普通PCR扩增的产物作为系列DNA标准品为 模板，采用本发明所述试剂盒进行巧光定量PCR扩增获得的标准曲线。
[0029] 图4是采用本发明所述试剂盒对小麦样品进行巧光定量PCR扩增获得的扩增曲线 图。
[0030] 图5是采用本发明所述试剂盒对小麦样品进行巧光定量PCR扩增获得的烙解曲线 图。
[0031] 图6小麦条诱菌、叶诱菌和杆诱菌的曲NA的PCR比较扩增结果，
[0032] 其中，点样孔中的样品从左至右依次为2个条诱、2个叶诱、2个杆诱；Marker条带 大小从下往上依次为lOObp，250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp。
[003引图7小麦杆诱菌与叶诱菌的特异性DM片段比对结果， 阳034]其中，6-1片段为小麦杆诱菌的特异性DNA片段，3-1片段为小麦叶诱菌的特异性DNA片段，其同源性为100%。
[003引图8小麦条诱菌与叶诱菌的特异性DNA片段比对结果，
[0036] 其中，1-5片段为小麦条诱菌的特异性DNA片段，3-1片段为小麦叶诱菌的特异性 DNA片段，其同源性为31. 23%。
[0037] 图9普通per验证本发明特异性引物的特异性：
[0038] 其中，泳道 1-5 :小麦条诱菌CY33,CY32,CY17,CY18,CY19 ;
[0039] 6-8,小麦叶诱菌PHT，THT，T皿；
[0040] 9-11，小麦杆诱菌 34C1,MFM;
[0041] 12-13,小麦白粉菌 1、10 ;
[0042] 14-15,小麦赤霉菌PH-1,PH-2 ;
[0043] 16-17,TCK;18,T化；19;TCT;20 ;d地20;Marker为肥B的LowMWDNALadder。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范 围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可W商购获 得。
[0045]牛物材料的夹源巧巧裁m化
[0046] 条诱菌CY33作为已知菌株可W商购获得；
[0047] 本发明采用的小麦受试材料为已知品种明贤169,由中国农科院植物保护研究所 麦类病害组保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于实验研究。
[0048] 小麦病原真菌菌种及来源：小麦诱菌菌种CY33、CY32、CY17、CY18、CY19;小麦叶诱 菌菌种PHT、THT、T皿；小麦杆诱菌菌种34CUMFM;小麦白粉菌1、10 ;小麦赤霉菌菌种PH-1、 PH-2;小麦矮腥黑穗病菌TCK;光腥黑粉菌菌种T化；网腥黑粉菌菌种TCT，均为公众已知菌 种，中国农业科学院植物保护研究所有保存，承诺自申请日起二十年内可向公众发放用于 实验研究。
[0049]丰要试剂 阳化0] 2XSG PCR Master Mix购自SinoGene，产品型号为#33-10201) ;2XSG Green qPCR Mix (with RO讶购自SinoGene，产品型号为#22-10102 ;质粒DM提取试剂盒；植物基 因组DM提取试剂盒；双蒸水。 W引]丰要化器巧备
[0052]分光光度计度io地otometer，Elppendorf);定量PCR仪（StepOnePLUS，Applied Biosystems)。
[0053] 实施例1、采用真菌保守基因引物分析小麦诱菌
[0054] 参照"Glass and Donaldson,1995."报道的化2a/Bt2b其核巧酸序列为： 阳化5] Bt2a :5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3,（SeqIDNo.1)， 阳化6] Bt2b:5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'(SeqIDNo. 2)。
[0057] 对小麦条诱菌、叶诱菌和杆诱菌曲NA的进行PCR分析，分析均在MJ Research,Inc.的PTC2220 型PC