一种柱状黄杆菌的检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鱼类致病菌的检测领域，涉及一种鱼类致病菌检测试剂盒以及检 测方法，尤其涉及一种柱状黄杆菌的检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 柱状黄杆菌（Flavobacteriumcolumnare)又名柱状纤维菌，为常见的鱼类 致病种，主要危害鱼类的鳃，也可引起体表溃疡。目前，针对该菌的检测和诊断技术颇 多，包括选择性培养基鉴别培养法、酶联免疫吸附试验（ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验 (D0T-ELISA)、单克隆抗体技术（MonoclonalAntibodyTechnique)，普通PCR(Polymerase ChainReaction)电泳检测法。这些方法各有其特点，但在生产应用中多表现出耗时长， 精确度低、敏感性和特异性差等缺点。而在检测和诊断技术中，荧光定量聚合酶链反应 (real-timepolymerasechainreaction，PCR)因其具有的简便、快速、敏感、特异、适于早 期和大量样品检测的优点，己在该研究领域得到广泛应用。目前对于柱状黄杆菌的检测国 内尚没有相关的定量PCR检测技术方面的研究报告。为了及时控制养殖鱼类鱼病发生，迫 切需要一种能快速检测鱼体内或养殖水体中是否存在致病菌的技术。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种检测柱状黄杆菌的试剂盒，包含了一种柱状黄杆菌gyrB基因 的荧光定量PCR检测方法的专用引物，该试剂盒是以待检样品中柱状黄杆菌gyrB基因为检 测对象，准确度及精密度均较好。本发明的另一个目的是提供一种检测柱状黄杆菌的荧光 定量检测方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] -种柱状黄杆菌的检测试剂盒，其特征在于：所述柱状黄杆菌的检测试剂盒包括 以柱状黄杆菌的gyrB基因为靶基因设计的一对引物：上游引物GyrB-11-F和下游引物 GyrB-11-R;所述
[0006] 上游引物GyrB-11-F:
[0007] 5' -TCTTGATGGGAATCGTGTGC-3' ；
[0008] 下游引物GyrB-11-R:
[0009] 5, -TGTTCCTCCTTCGTGCGTAT-3，。
[0010] 作为优选，本发明所采用的上游引物GyrB-n-F与下游引物GyrB-n-R的浓度比 是 3:5〇
[0011] 作为优选，本发明所采用的柱状黄杆菌的检测试剂盒还包括阳性对照物；所述阳 性对照物是重组质粒；所述重组质粒的序列是：
[0012] tcttgatgggaatcgtgtgcctattattggtcacgtaatttcaatggaaaatgacaaaggagaaatt cctgttgaagtagctttaatttataatgatagctattcagaaaatatattctcttacgtaaataatatcaatacg cacgaaggaggaaca〇
[0013] -种基于如上所述的柱状黄杆菌的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述检 测方法是实时荧光定量PCR检测方法。
[0014] 作为优选，本发明所采用的实时荧光定量PCR检测方法的反应体系是：
[0015] 5pmol/uL 的上游引物 GyrB-II-F 1. 5uL，5pmol/uL 的下游引物 GyrB-11-R 2.5uL，样品 DNA5uL，5U Taq DNA 聚合酶的 0.6uL，3uL DEPC 水，2X 进口实时荧光 PCR 缓 冲液12. 5uL ;所述12. 5uL的2 X进口实时荧光PCR缓冲液是2. 5uL的Takara公司的 10Xbuffer、2uL 的 10m MdNTP、0.0025uL 的 10000XSYBR green I 以及 8uL DEPC水的混合 物配制而成；所述PCR反应条件为：
[0016] 先防污染 37°C 5min ;然后预变性 95°C 3min ;最后扩增 95°C 10sec，60°C 40sec，共 40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
[0017] 本发明具有以下优点：
[0018] 1、首次提供了柱状黄杆菌gyrB基因荧光定量PCR检测中的专用引物，使利用荧光 定量PCR检测对待测样本中的柱状黄杆菌gyrB基因进行检测成为可能。
[0019] 2、本检测方法与柱状黄杆菌其它常规检测方法如细菌的分离培养鉴定、酶联免疫 吸附ELISA法和普通PCR相比，灵敏度和特异性极高，检测效率得到了很大的提高，并且有 效的防止了污染。
[0020] 3、本检测方法与柱状黄杆菌的其它常规检测方法，如细菌的分离培养鉴定、酶联 免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，本试剂盒可用于操作程 序化，适合大面积推广和应用。
[0021] 4、本检测方法不仅能够评价鱼体的柱状黄杆菌感染状况，同时也可用于水体或环 境中柱状黄杆菌的检测。
[0022] 综上所述，本发明能为快速、准确地检测出柱状黄杆菌提供了保证，对预防疾病， 科学用药，和保障鱼类健康提供了保障。依据本发明的专用引物的检测方法及试剂盒可用 于鱼类主要患病组织（鳃，体表）及水体或环境中柱状黄杆菌gyrB基因的核酸检测，应用 前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0023] 图1是采用三对引物分别对于柱状黄杆菌的目标靶基因进行扩增后的电泳图；
[0024] 图2是采用三对引物对柱状黄杆菌及六种非靶标鱼类致病菌的目标靶基因进行 扩增后的电泳图；
[0025] 图3是利用第二对引物GyrB-11-F/GyrB-II-R进行的标准品实时荧光定量PCR扩 增曲线图；
[0026] 图4是利用第二对引物GyrB-11-F/GyrB-II-R对病鱼DNA样本进行检测PCR扩增 曲线图。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。本发明的实 验方法均参照《精编分子生物学实验指南》（F.M.奥斯伯等主编，科学出版社2005年出版） 所建议的实验条件。
[0028] 实施例1 :用于对柱状黄杆菌gyrB基因进行荧光定量PCR检测的引物设计及筛选
[0029] 1.生物信息学方法设计引物及进行引物筛选
[0030] 下载GenBank收录的柱状黄杆菌的gyrB基因全序列（GeneBank :CP003222. 2)，同 时下载阴性对照菌gyrB基因全序列，阴性对照菌包括黄杆菌属其他物种及气单胞菌属，假 单胞菌属及河弧菌属相关物种，请见下表。通过Clustal X进行比对后，选择合适区域设计 引物，该区域在柱状黄杆菌种内保守，但相对于阴性对照至少存在10% -30%的差异，选定 区域后采用ABI Primer Express 3.0实时焚光定量PCR引物设计软件，设计合成引物。引 物中允许同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求 进行筛选：①引物长度（L)在19-28bp之间；②Tm值在58-60°C之间；⑧GC%在25-75%之 间；④polyN彡4bp ;⑤Hairpin彡4bp ;⑥覆盖率>90 %;⑦扩增产物长度控制在50-250bp 之间；⑧进行BLAST筛选，特异性分数〉LX0. 4。所用PCR引物由上海生工公司合成，引物要 求PAGE纯化，到货时为引物干粉，用无菌水复溶后，对干粉进行含量测定，引物至lOOpmol/ uL贮存液后备用。
[0031] 针对柱状黄杆菌gyrB基因，共设计了 3组上下游引物，序列如下：
[0032] GyrB-I
[0033] 上游引物（GyrB-1-F) :5' -CGTATGCGTGAGITGGCm-3' ；（157bp)
[0034] 下游引物（GyrB-1-R) :5' -TAGGCACACGAITCCCATCA-3'
[0035] GyrB-I I
[0036] 上游引物（GyrB-II-F) :5' -TCTTGATGGGAATCGTGTGC-3' ；（157bp)
[0037] 下游引物（GyrB-II-R) :5' -TGITCCTCCTTCGTGCGTAT-3'
[0038] GyrB-I II
[0039] 上游引物