， 本次优化上游引物在7. 5pmol，下游引物在12. 5pmol时检测结果较好，选择此浓度为本发 明实时荧光定量PCR引物的使用浓度。
[0076] 表3实时荧光定量PCR引物用量的第二次优化结果，
[0077]
[0078] 注：表格中注明值为Ct值，" 1. 0,1. 5, 2. 0, 2. 5"为25ulPCR体系中引物（浓度为 5pm〇le/ul)的用量（ul)以上优化结果表明，本发明柱状黄杆菌实时荧光定量PCR检测试剂 的基本组成和各组分含量基本如表4所示。
[0079] 表4柱状黄杆菌实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量
[0080]
[0081] 实施例3 :柱状黄杆菌gyrB基因荧光定量PCR检测
[0082] 1 ?标准曲线的建立
[0083] 1. 1将阳性对照质粒DNA作为模板进行荧光定量PCR检测，建立标准曲线。具体 操作如下：将质粒〇嫩进行10倍系列稀释成1 :1.0\101°拷贝/1^;11:1.0\109拷贝/1^ ; III :1. 0X108拷贝 /uL ;IV :1. 0X10 7拷贝 /uL ;V :1. 0X10 6拷贝 /uL ;VI :1. 0x10 5拷贝 / uL ;VH :1. 0X104拷贝 /uL ;麗：1. 0X10 3拷贝 /uL ;IX :1. 0X10 2拷贝 /uL ;X :1. 0X10 1 拷 贝luL ;XI :1. 0X 10°拷贝/uL。每个稀释度重复平行试验3次。标准品检测PCR反应体系 为：上游引物 1. 5ul (5pmol/ul)，下游引物 2. 5ul (5pmol/ul)，质粒 DNA 5uL，Taq DNA 聚合酶 (51])0.6此，实时荧光？〇?缓冲液（2\)12.5此（用购自131?^1公司的10\131^€612.51^， 2uL 的 lOmMdNTP 以及的 10000XSYBR green I 0.0025uL 和 8uL DEPC 水的混合物配制而 成），补充无菌水至25uL。PCR反应条件为：先防污染37°C 5min;然后预变性95°C 3min; 最后扩增95°C l〇SeC，60°C 40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检 测。标准品实时荧光定量PCR扩增曲线如图3所示（图3,横坐标为Ct值，纵坐标为荧光 值，1 :1. 0X101。拷贝 /uL ;2 :1. 0X10 9拷贝 /uL ;3 :1. 0X10 8拷贝 /uL ;4 :1. 0X10 7拷贝 / 1^;5:1.0\106拷贝/此；6 :1.(^105拷贝/1^;7:1.0\104拷贝/1^ ;8:1.0\103拷贝/111; 9 :1. 0X102拷贝 /uL ;10 :1. 0X10 1 拷贝 luL ;11 :1. 0X10 ?拷贝 /uL。）
[0084] 1. 2标准曲线的绘制
[0085] 根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线（图3,横坐标为拷 贝数的对数，纵坐标为Ct值），由图3可知，实时荧光定量PCR检测超级细菌的线性 范围是IX 10s~IX 10 2拷贝/反应体系，标准曲线的相关系数R平方值为1.003(y =-3. 1365X+36. 201)，荧光定量PCR反应的扩增效率为99. 6%。标准曲线显示：本发明建 立的柱状黄杆菌gyrB基因实时荧光定量PCR检测方法有9个数量级的线性检测范围，进一 步说明该检测方法的具有非常高的灵敏度。
[0086] 2.实时荧光定量PCR法检测20份鱼类样本
[0087] 2. 1提取鱼取样组织的DNA
[0088] 采集了 10份患病及疑似患病的草鱼样品及10份健康草鱼样品，使用 che 1 ex-100 (Bio-Rad)煮沸法快速提取DNA。方法如下：取一小块鳃组织块，加入200uL Millipore H20,捣烂，取出没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12,000rpm离心lmin，弃上清， 加入200uLMillipore H20重悬。充分混匀后取50uL加入到200uL 6%的chelex-100中，混 匀，56°C保温20min，剧烈震荡混匀后于100°C保温8min，剧烈震荡，并于12,000离心3min， 取上清作为PCR的模板，用建立的常规PCR检测体系进行检测。剩余的模板于-20°C保存以 备复检。
[0089] 2. 2用实施例1，2中建立的方法检测病鱼DNA样本
[0090] 病鱼检测PCR反应体系为：上游引物1. 5ul(5pmol/ul)，下游引物2. 5ul(5pmol/ ul)，质粒DNA 5uL，5U Taq DNA聚合酶的0. 6uL，3uL DEPC水，2X进口实时荧光PCR缓冲液 的12. 5uL ; 12. 5uL的2 X进口实时荧光PCR缓冲液是2. 5uL的Takara公司的10 X buffer， 2uL 的 lOmMdNTP、10000 X SYBR green I 0? 0025uL 以及 8uL DEPC 水的混合物配制而 成。PCR反应条件为：先防污染37°C 5min ;然后预变性95°C 3min ;最后扩增95°C lOsec， 60°C 40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。标准品实时荧光定 量PCR扩增曲线如图4所示（图4,横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值），结果显示：以确诊的 10份柱状黄杆菌感染鱼标本DNA为模板时出现了目的模板时出现了目的荧光扩增曲线，以 其余10份样本的DNA为模板时，均无扩增曲线。
[0091] 实施例4 :柱状黄杆菌gyrB基因荧光定量PCR检测试剂盒
[0092] 柱状黄杆菌gyrB基因荧光定量PCR检测试剂盒包括各自独立包装的柱状黄杆菌 反应液lml/管和Taq聚合酶（5U，每个反应0. 6uL) 30ul/管，两试剂管再共同组装在一外 包装盒中。其中，柱状黄杆菌反应液为含有dNTPs、MgC12、SYBR green I及引物混合液，由 12. 5uL 的 2Xbuffer(用购自 Takara 公司的 lOXbuffer 2. 5ul，2uL 的 10mM dNTP 以及的 10000XSYBR green I 0.0025uL和8uL DEPC水的混合物配制而成）、实施例2确定的DM-2 组合中1. 5uL上游引物、2. 5uL下游引物和1. 9ul的DEPC水按比例混合，配制时将每一组 分乘以一个系数（如10000,根据生产量定），混匀后，分装，每支lmL为方便检测，试剂盒还 可以包括另外各自独立包装的强阳性对照品（10 5稀释度的阳性对照品质粒L2)、临界阳性 对照品（10 8稀释度的阳性对照品质粒L5)、DNA提取液（配方为：chelex-100)及阴性对 照品（无菌水），并与柱状黄杆菌反应液和Taq聚合酶试剂管共同组装在外包装盒中。PCR 反应体系：上游引物 1. 5uL(5pmol/uL)，下游引物 2. 5uL(5pmol/uL)，样品 DNA5uL，Taq DNA 聚合酶（5U)0.6uL，实时荧光PCR缓冲液（2X) 12. 5uL(用购自Takara公司的lOXbuffer 2. 5uL，2uL 的 lOmMdNTP 以及的 10000 X SYBR green 10. 0025uL和 8uL DEPC水的混合物配制 而成），补充无菌水至25uL。PCR反应条件为：先防污染37°C 5min ;然后预变性95°C 3min ; 最后扩增95°C l〇SeC，60°C 40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检 测。结果表明（表5,经过5次重复测定结果比较稳定，确定为本发明试剂盒的阳性对照。
[0093] 表5阳性对照的测试结果
[0094]
[0095] 实施例5 :柱状黄杆菌gyrB基因荧光定量PCR检测试剂盒的性能评估
[0096] 为对本发明试剂盒的性能进行评估，按照产品优化后的工艺多次配制出产品小样 对试剂盒的灵敏度、特异性、精确度、以及稳定性，以及用试生产的产品进行临床试验，以考 查产品的性能。
[0097]1、试剂盒检测的线性范围和灵敏度测试将柱状黄杆菌gyrB基因人工构建质 粒pBlue-GyrB-I用DEPC水稀释液进行10倍系列梯度稀释至10 9,即灵敏度质控品（取 Ll(104稀释度）、L2(10 5稀释度）、L3(10 6稀释度）、L4(10 7稀释度）、L5(10 8稀释 度）