一种筛查多发性内分泌瘤的基因诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种筛查多发性内分泌瘤的基因诊断试剂盒，更具体说是一种利用 MEN1基因外显子突变检测的试剂盒，该试剂盒及方法可用于该疾病的辅助诊断，属于生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 多发性内分泌肿瘤（multipleendocrineneoplasia，MEN)是一组多个不同的内分 泌腺体在同一个体先后或同时发生、以功能亢进为主要表现的显性遗传性疾病。其中，多发 性内分泌肿瘤I型（MEN-1)主要累及甲状旁腺、垂体和胰腺内分泌。国外文献报道MEN-1 的发病率约为1/20000~1/50000。
[0003] MEN-1主要由胚系的MEN1基因发生突变所致，外显率很高，至60岁时95 %~ 100%的病人发病。MEN1基因为一抑癌基因，位于染色体llql3,全长9kb，包含10个外显 子，编码一个由610个氨基酸组成的蛋白menin。MEN1基因突变类型众多，均造成menin表 达缺失，而menin掌控细胞增殖的终止，其功能异常导致细胞过度增殖，发生肿瘤。病人出 生时，已在生殖细胞水平携带一个异常突变的等位基因，即杂合缺失（L0H)，这是第一次打 击，但由于另一个等位基因正常，所以并未发生具体病变。而一旦在体细胞水平发生另一个 正常等位基因丢失的第二次打击，则出现病症。如第二次打击发生在胰岛细胞内，病人就发 生胰岛细胞肿瘤。
[0004] 多发性内分泌肿瘤I型（MEN-1)由MEN1抑癌基因突变所致，其具有病理类型多 样、发病早、多发等特点，基因测序是重要诊断方法。Rrandi等在多内分泌腺瘤病1型的诊 疗指南中指出，对于多内分泌腺瘤病1型的先证者及其未受累的亲属，都应当进行MEN1基 因的筛查，所有的家系成员都有可能发生MEN1基因突变。对于基因筛查发现的MEN1突变 基因携带者，应当定期进行生化和影像检查，筛查肿瘤的发生。
[0005] 综上，对Mnel基因外显子区进行分型检测可为多发性内分泌瘤1型早期筛查已经 临床诊断提供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测MEN1基因多态性的试剂盒将 为多发性内分泌瘤1型诊断及时性及准确性。
[0006] Sanger测序技术是一种成熟的DNA序列分析技术，该技术可对未知DNA序列进行 分析，DNA片段也无需荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简单、检测成本 低、所需样本量小、快捷、准确、结果分析简便，符合临床应用检测要求。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种筛查多发性内分泌瘤的基因诊断试剂盒，适用于临床 检测多发性内分泌瘤诊断基因MEN1突变，能实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测 多发性内分泌瘤I型早期筛查及临床诊断。
[0008] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0009] -种筛查多发性内分泌瘤的基因诊断试剂盒，包含如下引物：
[0010] (1)扩增引物：
[0011] MENlexon2(SEQIDNO. 1)上游引物：5'-TGGAACCTTAGCGGACCCT-3，（SEQ IDNO. 1)
[0012] MENlexon3(SEQIDNO. 2)上游引物：5'-AGGAGAATCTGAGGTTGGGT-3'（SEQ IDNO. 2)
[0013] MENlexon4(SEQIDNO. 3)上游引物：5'-GGGCCATCATGAGACATAATG-3'（SEQ IDNO. 3)
[0014] MENlexon5/6(SEQIDNO. 4/SEQIDNO. 5)上游引物：5'-GATAGGCTAAGGACC CGTTCT-3,(SEQIDNO. 4)
[0015] MENlexon7(SEQIDNO. 6)上游引物：5'-GGCTGCCTCCCTGAGGATC-3'（SEQ IDNO. 5)
[0016] MENlexon8(SEQIDNO. 7)上游引物：5'-GTGAGACCCCTTCAGACCCTA C-3'（SEQIDN0.6)
[0017] MENlexon9(SEQIDNO. 8)上游引物：5'-GGGTGAGTAAGAGACTGATCTGTG C-3'（SEQIDNO. 7)
[0018] MENlexon10(SEQIDNO. 9)上游引物：5'-TCTCACCTTGCTCTCCCCAC-3'（SEQ IDNO. 8)
[0019] MENlexon2 下游引物：5'-AAATAACACCTGCCGAACCTC-3,（SEQIDNO. 9)
[0020] MENlexon 3 下游引物：5' -GTGGCTTGGGCTACTACAG-3'（SEQIDNO. 10)
[0021] MENlexon 4 下游引物：5' -CTGCCCCATTGGCTCAG-3,（SEQIDNO. 11)
[0022] MENlexon5/6 下游引物：5'-AGACTGGATGGGCGATACC-3'（SEQIDNO. 12)
[0023] MENlexon 7 下游引物：5' -CTGGACGAGGGTGGTTGG-3,（SEQIDNO. 13)
[0024] MENlexon 8 下游引物：5' -TGGGAGGCTGGACACAGG-3,（SEQIDNO. 14)
[0025] MENlexon9 下游引物：5'-TGTAGTGCCCAGACCTCTGTG-3'（SEQIDNO. 15)
[0026] MENlexon10 下游引物：5'-AGAACATGGGCTCAGAGTTGG-3,（SEQIDNO. 16)
[0027] (2)测序引物：
[0028] MENlexon2 测序引物 1 :5'-TGGAACCTTAGCGGACCCT-3，（SEQIDNO. 17)
[0029] 测序引物 2 :5'-AAATAACACCTGCCGAACCTC-3'（SEQIDNO. 18)
[0030] MENlexon3 测序引物 3 :5'-AGGAGAATCTGAGGTTGGGT-3'（SEQIDNO. 19)
[0031] 测序引物 4 :5'-GTGGCTTGGGCTACTACAG-3'（SEQIDNO. 20)
[0032] MENlexon4 测序引物 5 :5'-GGGCCATCATGAGACATAATG-3，（SEQIDNO. 21)
[0033] 测序引物 6 :5'-CTGCCCCATTGGCTCAG-3,（SEQIDNO. 22)
[0034] MENlexon5/6测序引物7 :5'-GATAGGCTAAGGACCCGTTCT-3'（SEQIDNO. 23)
[0035] 测序引物 8 :5'-AGACTGGATGGGCGATACC-3'（SEQIDNO. 24)
[0036] MENlexon7 测序引物 9 :5'-GGCTGCCTCCCTGAGGATC-3'（SEQIDNO. 25)
[0037] 测序引物 10 :5'-CTGGACGAGGGTGGTTGG-3'（SEQIDNO. 26)
[0038] MENlexon8测序引物 11 :5'-GTGAGACCCCTTCAGACCCTAC-3'（SEQIDNO. 27)
[0039] 测序引物 12 :5'-TGGGAGGCTGGACACAGG-3'（SEQIDNO. 28)
[0040] MENlexon9 测序引物 13 :5'-GGGTGAGTAAGAGACTGATCTGTGC-3,（SEQID NO. 29)
[0041] 测序引物 14 :5' -TGT AGT GCC CAG ACC TCT GTG-3'（SEQ ID NO. 30)
[0042] MENlexon 10 测序引物 15 :5'-TCT CAC CTT GCT CTC CCC AC-3'（SEQ ID NO. 31)
[0043] 测序引物 16 :5' -AGA ACA TGG GCT CAG AGT TGG-3'（SEQ ID NO. 32)
[0044] 本发明所述试剂盒中的其他试剂及溶液为PCR和Sanger测序的常规试剂。
[0045] 本发明还提供了一种检测多发性内分泌瘤I型即MEN-1基因多态性的方法，该方 法包括：提供权利要求1所述的筛查多发性内分泌瘤I型即MEN-1的基因诊断试剂盒；以从 个体血液或组织提取的DNA为模版，通过基因诊断试剂盒针对Men 1基因外显子2、3、4、5、6、 7、8、9、10序列进行PCR反应；将得到的PCR产物进行测序分析，将所得标本序列与正常人 基因序列进行比对，确认是否有突变；根据以上结果判断待测个体是否为MEN1基因突变导 致患多发性内分泌瘤风险。
[0046] 根据本发明所述的检测方法的进一步特征，采用50ul PCR扩增体系，包括： 10XPCR缓冲液5ul，dNTP 3. Oul，上游引物0? 5ul，下游引物0? 5ul，rTaq 0? 5ul，水38. 5ul， 模版2.0ul ;按照下面的的循环参数设置基因扩增仪：95°C 5min预变性；然后依次在 95°C 30s，56-60°C 30s，72°C 30s，进行 35 个循环；再 72°C保持 10min，最终保持在 12°C，得 扩增产物。
[0047] 由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒适用于 MEN1基因突变检测，可为多发性内分泌瘤I型诊断和筛查提供依据。Sanger测序技术可以 快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点； PCR产物即可直接用于测序，不需要进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量 小。
【附图说明】
[0048] 图1为本发明MENlexon2Sanger测序结果示意图。
[0049] 图2为本发明MENlexon3Sanger测序结果示意图。
[0050] 图3为本发明MENlexon4Sanger测序结果示意图。
[0051] 图4为本发明MENlexon5/6Sanger测序结果示意图。
[0052] 图5为本发明MENlexon7Sanger测序结果示意图。
[0053] 图6为本发明MENlexon8Sanger测序结果示意图。
[0054] 图7为本发明MENlexon9Sanger测序结果示意图。
[0055] 图8为本发明MENlexonlOSanger测序结果示意图。
【具体实施方式】
[0056] 下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。
[0057] 实施例1
[0058] MENlexon 2 上游引物：5' -TGG AAC CTT AGC GGA CCC T-3'
[0059] MENlexon 3 上游引物：5' -AGG AGA ATC TGA GGT TGG GT-3'
[0060] MENlexon 4 上游引物：5' -GGGCCATCATGAGACATAATG-3'
[0061]MENlexon 5/6 上游引物：5' -GAT AGG CTA AGG ACC CGT TCT-3'
[0062] MENlexon 7 上游引物：5' -GGCTGCCTCCCTGAGGATC-3'
[0063] MENlexon 8 上游引物：5' -GTGAGACCCCTTCAGACCCTAC-3'
[0064] MENlexon 9 上游引物：5' -GGGTGAGTAAGAGACTGATCTGTGC-3'
[0065] MENlexon10 上游引物：5'-TCTCACCTTGCTCTCCCCAC-3'
[0066] MENlexon 2 下游引物：5' -AAATAACACCTGCCGAACCTC-3'
[0067] MENlexon 3 下游引物：5' -GTGGCTTGGGCTACTACAG-3，
[0068] MENlexon 4 下游引物：5' -CTGCCCCATTGGCTCAG-3，
[0069] MENlexon 5/6 下游引物：5'-AGACTGGATGGGCGATACC-3'
[0070] MENlexon 7 下游引物：5' -CTGGACGAGGGTGGTTGG-3，
[0071] MENlexon 8 下游引物：5' -TGGGAGGCTGGACACAGG-3，
[0072] MENlexon 9 下游引物：5' -TGTAGTGCCCAGACCTCTGTG-3，
[0073] MENlexon10 下游引物：5'-AGAACATGGGCTCAGAGTTGG-3，
[0074] 测序引物：
[0075] MENlexon2 测序引物 1 :5'-TGGAACCTTAGCGGACCCT-3，
[0076] 测序引物 2 :5'-AAATAACACCTGCCGAACCTC-3'
[0077] MENlexon3 测序引物 3 :5'-AGGAGAATCTGAGGTT