一种肺癌筛查试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肺癌筛查试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，目前 发病率居世界首位，严重威胁着人类健康和生命。
[0003] 肺癌的病因复杂，一般认为影响因素包括:①吸烟；②环境污染：如雾霾、室内装 修;③不良生活方式:如饮食习惯差、生活压力大;④慢性肺部疾病:如肺结核、尘肺，砂肺、 慢性支气管炎;⑤人体内在因素:如家族遗传、免疫机能降低、内分泌功能失调等。
[0004] 同时，肺癌是一种善于隐匿的疾病，经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状，70 ~80%的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期，癌细胞已经扩散，错过了最佳治 愈时机，五年生存率低。对于早期的肺癌患者，经过及时治疗可大大提高患者的5年及以上 生存率和生存质量。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。
[0005] 肺癌的筛查，是指对那些没有肺癌相关症状的人群进行常规体检，在出现症状前 及时发现肺癌。如果可以找到血液里面的肺癌分子标志物，用于提示临床医生早期对患者 采取相关的治疗措施或者决策具有重要的意义。
[0006] 热休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)，是一种生物进化上高度保守的 蛋白质，其主要作用为协助多肽或蛋白质的正确转位、折叠和装配。关于HSP60与肺癌，仅有 文献报道HSP60在肺腺癌患者组织中不表达，在有吸烟史的慢性阻塞性肺病患者(C0PD)中， 支气管癌变的C0PD患者肺组织中表达的HSP60水平低【Cappello F etal，Hsp60and HsplOdown-regulation predicts bronchial epithelial carcinogenesis in smokers with chronic obstructive pulmonary disease[J]，Cancer，2006，107(10):2417-24]。目 前未见关于血浆HSP60与肺癌相关的报道。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，发明人对肺癌进行了详细研究，发现了 HSP60可以作为其分子 标志物。其中，HSP60在血清中的表达水平与肺癌呈正相关。因此，通过检测血清中HSP60的 表达水平，可以预测待检人群患肺癌的风险。
[0008] 据此，本发明提供了一种肺癌筛查试剂盒，以及检测HSP60的表达水平的试剂在制 备肺癌筛查试剂中的用途。
[0009] 本发明的肺癌筛查试剂盒，它包括任选的用于检测HSP60表达水平的试剂。
[0010] 其中，所述试剂是用于检测血清中HSP60表达水平的试剂。
[0011]其中，所述检测HSP60表达水平的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。
[0012] 其中，所述检测HSP60表达水平的试剂为ELISA检测方法用试剂或Western Blot检 测方法用试剂。
[0013]本发明还提供了检测HSP60表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。
[0014] 其中，所述试剂是用于检测血清中HSP60表达水平的试剂。
[0015]其中，所述检测HSP60表达水平的试剂为蛋白芯片检测方法用试剂。
[0016] 其中，所述检测HSP60表达水平的试剂为ELISA检测方法用试剂或Western Blot检 测方法用试剂。
[0017] 本发明试剂盒通过检测HSP60的表达水平，可以判断待检人群患肺癌的风险：若 HSP60的表达水平高，则患肺癌的风险高，若HSP60的表达水平低，则患肺癌的风险低，可用 于临床肺癌的辅助诊断，临床应用前景良好。
[0018] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0019]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0020]图1为早期肺癌患者与健康对照血浆HSP60检测结果图
【具体实施方式】
[0021]实施例1HSP60表达水平与肺癌的关系 [0022]实验方法如下：
[0023] -、临床资料
[0024] 选取早期肺癌患者15例，健康对照10例，基本信息如下：
[0025]
[0026] 二、HSP60表达水平的检测（定量检测HSP60的含量）
[0027] 采用在RayBiotech公司购买的AAH-BLG-CUST试剂盒(货号:AAH-BLG-CUST)，按照 如下方法检测HSP60的表达水平：
[0028] 1、样品透析
[0029] 抽取肺癌患者及健康对照的血液，EDTA抗凝后离心（1200rpm，10min)，将上清吸取 后进行第二次离心（3000rpm，15min)，吸取第二次离心后的上清即血浆，作为检测标本，分 装后-80°C保存。
[0030] 血浆样品在生物素标记前需要利用透析管进行透析。分别取样品100此加入到透 析管中，然后在4000mL的1 X ros(pH = 8)中4 °C边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次， 透析三次后收集样品至1.5mL离心管。
[0031] 注：1XPBS的配制：1.0g KCl，40gNaCl，1.0g KH2P04,5.75g Na2HP04用4,500ml去 离子水溶解，用1M NaOH调节pH=8.0，最后用去离子水定容至5，000ml。
[0032] 2、生物素标记样品
[0033]在整个生物素标记样品的过程，避免任何试剂受到胺类物质或叠氮钠(或Tris，甘 氨酸)的污染。
[0034] 1)使用标记试剂前，将标记试剂(Labeling Reagent)小管快速离心后，管中加入 100yL 1 X PBS溶解标记试剂粉末，上下吹打将标记试剂混匀，制备成1 X标记试剂溶液。 [0035] 2)向装有35ul样本的离心管中加入22ul的IX标记试剂溶液和155ul标记缓冲液。 快速混匀，摇床上室温孵育30min，每5min轻弹离心管，混合反应试剂。
[0036] 3)孵育30min后，在上步反应液中加入3yL终止液（Stop Solution);
[0037] 4)分别取样品已加入终止液后样品各100yL加入透析管中，然后在4000
[0038] mL的1 XPBS(pH=8)中4°C边搅拌边透析。间隔3小时更换透析液一次。
[0039]透析三次以后收集样品。
[0040] 3、玻片芯片的完全干燥
[0041 ]将玻片芯片（RayBio? Biotin label-based human antibody array land 2)从 盒子中取出来，在室温平衡20_30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空 干燥器或者室温干燥1-2小时。
[0042] 4、封闭和孵育
[0043] 1)每个芯片孔中加入100yL的封闭缓冲液(Blocking Buffer)，室温摇床上孵育 lh，避免产生气泡；
[0044] 2)抽去封闭液，每个孔中添加100yL透析后样品，一个阵列一个样品，4°C振荡孵育 12-16h〇
[0045] 3)清洗
[0046] 使用Thermo Scientific Weilwash Versa芯片洗板机清洗玻片，分为两步：首先 用1 X洗液I(Wash Buffer I)(用去离子水稀释20X洗液I得到）进行清洗，每孔250yL的1 X 洗液I，清洗5次，每次震荡10s，震荡强度选择高；然后换用1 X洗液II通道进行清洗，每孔 250yL的1 X洗液II (Wash Buffer II)(用去离子水稀释20 X洗液II得到），清洗3次，每次震 荡l〇s，震荡强度选择高。
[0047] 4)抽去IX洗液II，每孔加入100uL用封闭液1500稀释的Cy3equiVal ent室温避光 振荡孵育2小时。
[0048] 5)按照步骤3)和4)洗玻片。
[0049] 5、荧光检测
[0050] 采用激光扫描仪例如Axon Ge