一种结直肠癌早期诊断标记物及相关试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种结直肠癌早期诊断标记物，特别是由血浆microRNA组成的结直 肠癌早期诊断标记物，以及由该结直肠癌早期诊断标记物构建的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，根据世界卫生组织（WHO)报道，结直肠 癌是男性第三位和女性第二位常见的恶性肿瘤。2012年全球男性结直肠癌新发病例为 746000例，占所有恶性肿瘤10% ;女性结直肠癌新发病例为614000例，占所有恶性肿瘤 9. 2%。近年来在我国的发病率和死亡率不断攀升，每年新增病例已超过17万人，死亡近10 万人，发病率位居我国恶性肿瘤第三，直追欧美国家。根据广州市2013年9月公布的恶性 肿瘤发病及死亡率统计结果，男女结直肠癌发病率分别上升了 53. 31 %和39. 35%，发病率 位居第二位，死亡率位于所有恶性肿瘤中第三位。
[0003] 过去50年来尽管结直肠癌手术方式和辅助治疗手段不断发展，结直肠癌根治性 手术后生存率却无太大变化，约50%患者术后因局部复发或转移而最终死亡。预后不良的 主要原因之一是就诊时绝大部分患者已属中晚期，仅56%患者可行根治性切除。死因直接 与分期较晚有重要关联。以国际抗癌联盟（UICC)和美国肿瘤联合会（AJCC)联合制定的最 新??!分期系统为标准，根据现有的统计资料，I、Ila、Ilb、Ilia、Illb、IIIc和IV期结直 肠癌患者的5年生存率分别为93. 2%、84· 7%、72· 2%、83· 4%、64· 1%、44· 3%和8· 1%，可 见早期诊治的重要性。
[0004] 结直肠癌大多经历了正常粘膜~腺瘤~腺癌的发展过程，即Nomal-Adenoma一 Adenocarcinoma(N. A. AC)学说。腺癌是结直肠癌最主要的组织学类型，而腺瘤是目前被公 认为结直肠腺癌最重要的癌前病变。结直肠癌早期不易发现，绝大多数患者在出现便血、腹 痛等症状三个月到半年后才到医院就诊。届时癌细胞已扩散甚至向远处转移，失去了最佳 的手术治疗时机。此外，若发生肠阻塞或肠穿孔，患者的5年生存率会进一步降低；同时组 织学分化差（除外MSI-H样肿瘤），淋巴管/血管侵犯，神经侵犯，或切缘接近、不确定或阳 性在NCCN指南中均被认为是预后不良的因素。尽管诊疗技术不断发展，患者术后5年生存 率并无明显改善，缺乏有效的诊断方法实现对结直肠腺癌及其癌前病变的早期诊断是主要 的原因之一，若能早期发现并切除结直肠腺癌及其腺瘤病变，将有助于降低其发病率及死 亡率。
[0005]目前，早期发现结直肠肠癌的主要途径以粪便隐血试验（FOBT)作为结直肠癌主 要的普查手段，筛选出高危人群进行肠镜检查。然而FOBT缺乏特异性，初筛顺应性及高危 人群的肠镜受检率仅30% -40%，疾病检出率约19%左右，有待进一步提高。我国人口众 多，结直肠癌发病率上升极为明显，进一步筛选出肠镜需检的人群更为必要。利用无创的肿 瘤标志物对高危人群进行肠镜筛查，可缩小肠镜检查人数且进一步提高肠镜的特异性及灵 敏度。目前临床上推荐用于诊断与预后判断的重要肿瘤标志物有CEA，但其特异性以及在结 直肠癌诊断方面的应用备受质疑。因此，目前的结直肠癌肿瘤标志物远远不能满足临床需 求，寻找理想的用于早期诊断结直肠癌肿瘤标志物具有重要的临床意义。
[0006] miRNA是一种分布广泛的具有调控功能的内源性非编码RNA，长约18~25个核苷 酸，其通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并能使靶mRNA降解或者阻遏靶mRNA的翻译， 从而在转录后对靶标基因的表达水平进行调节，参与细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。 miRNA表达具有组织特异性和时序性，在细胞生长和发育过程中起多种调节作用，参与各种 调节途径，与许多疾病有关尤其是恶性肿瘤。血浆中存在着大量miRNA，不同肿瘤中miRNA 的表达谱也不同，提示血浆miRNA可作为新的肿瘤标志物，用于肿瘤的诊断甚至治疗。作为 潜在的生物标志物，miRNA具有蛋白标志物无法比拟的优势，有研究显示miRNA的在血液中 以核酸-蛋白复合物形式存在或包被于外排颗粒当中，使miRNA耐受包括核糖核酸酶、反 复冻融、PH变化、长期保存等情况，不易被降解，在血液中稳定性非常好。近年来，肿瘤相关 miRNA陆续在肿瘤患者的血液中被发现，为肿瘤的无创性早期诊断提供了一条新的途径。例 如，人血清中 Let-7、miR-9、miR_15a、mi26a、miR-155、miR-34、miR-220 等的高表达分别与 胰腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病等疾病密切相关。然而，单一 miRNA作为标志物的敏感 性和特异性仍难以满足临床需求，将差异miRNA组合建立肿瘤特异性表达谱将改进单一分 子标志物难以克服的低灵敏度、低特异性问题，成为早期诊断的有效手段。若能获得特异性 结直肠癌血浆miRNA组合表达谱，可为其早期诊断提供一条新的途径。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个方面是提供一种结直肠癌早期诊断标志物。
[0008] 本发明所述的结直肠癌早期诊断标志物是由7种核酸分子组成，所述的核酸分 子包含编码血浆 miR-1183、miR-938、miR-490-3p、miR-490-5p、miR-592、miR-193b 和 miR-1290的核酸分子；所述的核酸分子在至少一种靶血浆中与在至少一种对照血浆中差 异表达。
[0009] 根据权利要求1所述的结直肠癌早期诊断标志物的进一步特征，编码血浆 miR-1183、miR-938、miR-490-3p、miR-490-5p、miR-592、miR-193b 和 miR-1290 的核酸分 子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表达相比被上调；以及编码血浆 miR-490_5p和miR-592的核酸分子在至少一种革El血衆中的表达与在至少一种对照血衆中 的表达相比被下调。
[0010] 本发明同时提供一种包括上述结直肠癌早期诊断标志物的结直肠癌早期诊断试 剂盒。
[0011] 本发明的第二个方面是提供另一种结直肠癌早期诊断标志物。
[0012] 本发明所述的结直肠癌早期诊断标志物是由5种核酸分子组成，所述的核酸分 子包含编码血浆 miR-1183、miR-938、miR-490-3p、miR-490-5p、miR-592、miR-193b 和 miR-1290的核酸分子；所述的核酸分子在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血 浆中的表达相比被上调。
[0013] 本发明同时提供一种包括上述结直肠癌早期诊断标志物的结直肠癌早期诊断试 剂盒。
[0014] 根据本发明所述的结直肠癌早期诊断试剂盒的进一步特征，所述试剂盒还包括一 个回归模型，建立 Iogit(P)判别公式如下：logit(P) =-8. 653+49. 783X(miR-1183)+16. 666 X (miR-938)+235. 243 X (miR-490-3p)+0· 690 X (miR-193b)+18. 096 X (miR-1290)，其 中，111丨1?-1183、111丨1?-938、111丨1?-1290、111丨1?-490-3口以及111丨1?-19313的表达水平是以1]6为内参检 测得到，模型中的logit (P)值在至少一种靶血浆中的表达与在至少一种对照血浆中的表 达相比被上调。
[0015] U6是一类核小分子RNA，已有文献证实它在人血浆中存在并且表达比较恒定，本 发明将它做为内参基因，以检测miRNA的相对表达量（Λ CT = CTt_ ^irna-CT内参）。
[0016] 根据本发明所述的诊断试剂盒的进一步特征，所述早期结直肠癌是结直肠高级别 上皮内瘤变。
[0017] 根据本发明所述的诊断试剂盒的进一步特征，所述早期结直肠癌是?M I期的结 直肠癌。
[0018] 本发明的第三个方面是提供一种用于区分至少一个结直肠癌患者的血浆和至少 一个健康个体的血浆的试剂盒。
[0019] 本发明所述的一种用于区分至少一个结直肠癌患者的血浆和至少一个健康个体 的血浆的试剂盒，包括上述的结直肠癌早期诊断标志物，其中，至少一种对照血浆来自健康 个体。
[0020] 根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述试剂盒还包括一个回归模型，建 立 Iogit(P)判别公式如下：logit (P) = -8. 653+49. 783 X (miR-1183)+16. 666 X (miR-938 )+235. 243X (miR-490-3p)+0. 690X (miR-193b)+18. 096X (miR-1290)，其中，miR-1183、 miR-938、miR-1290、miR-490-3p以及miR-193b的表达水平是以U6为内参检测得到，模型中 的Iogit(P)值在至少一种革El血衆中的表达与在至少一种对照血衆中的表达相比被上调。
[0021] 本发明将在结直肠癌组织内异常表达明显且较恒定的miRNA确