一种检测肿瘤标记物ca72-4的免疫磁珠试纸条及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物应用技术领域，特别涉及一种检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条及制备方法。
【背景技术】
[0002]胃癌是世界上最常见和高致死率的恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一，占消化道恶性肿瘤死亡原因的第一位，有些地区占全部恶性肿瘤死亡原因的首位，且胃癌发病率一直居高不下。有资料显示，我国每年新发胃癌患者40万人，死亡人数30万人，且青年人患胃癌的比例在增加，15%左右患者为40岁以下年轻人。在中国，胃癌早期诊断率不足10%，患者诊断成胃癌时已达到晚期胃癌阶段，其5年生存率不足30%;而经过早期诊断、早期治疗、及时进行相关的医疗干预措施，可使其5年生存率达到80% -90%。因此，开发早期胃癌检测方法可提高患者的预后。目前绝大多数医院主要依赖X线、B型超声、内窥镜检查以及活组织病理学检查等方法对肿瘤进行诊断。以上这些检查有些对患者创伤较大，有些价格较为昂贵，需要精密的仪器设备及熟练操作的技术人员，所以难以用于大规模肿瘤检查或健康体检，进而无法提高早期胃癌的诊断率。同时，辅助的检查手段还包括肿瘤的免疫学反应、体内特殊化学成分的测定及酶反应等。
[0003]人体细胞从正常向恶性转化过程中，新陈代谢结果使细胞表面糖蛋白和糖脂发生某些变化，表现出肿瘤细胞表面糖类抗原的升高。这些抗原可能发生脱落，通过检测这些脱落的抗原可对肿瘤进行辅助诊断、监测疗效及复发。不同于组织病理标本，血清肿瘤标记物检测只需外周血采样，简单易行，便于反复检查，较适合于临床上常规的检查、高危人群的普查和长期随访。
[0004]CA72-4是一种高分子量糖蛋白，在各种消化道肿瘤和卵巢癌中出现异常升高。对胃癌有较高的敏感性，血清CA72-4在胃癌中的阳性率文献报道为36 %?94%，其特异性也较高，部分甚至达到100%。相关研宄指出血清CA72-4阳性率在早期胃癌与消化道良性疾病组间存在显著差异，亦有报道指出进展期胃癌中其阳性率均随胃癌期别的增高而上升，提示CA72-4水平与肿瘤大小、浸润深度、分期及淋巴结受累等肿瘤生物学行为相关。不同类型的胃癌CA72-4阳性率亦不同，从肿瘤分化程度来看，分化差的肿瘤其CA72-4含量明显高于分化好的肿瘤，其中以未、低分化胃癌患者最高，为72%，中、高分化癌63%，其他如印戒细胞癌、残胃癌等约为14.3%，提示CA72-4与肿瘤病理分型关系密切。CA72-4还与胃癌患者浆膜受累、肝转移、腹膜受累和术后生存期缩短相关。胃癌切除术后血清CA72-4较术前降低，手术前后比较有显著性差异，因而CA72-4也可用于检测术后是否有残留肿瘤细胞。
[0005]目前，对于患者血液中肿瘤标记物的检测主要依赖免疫学检测技术。免疫学方法是基于抗原抗体特异性反应而建立的一种检测方法，具有快速，敏感，特异，简便，结果易于判断等特点。主要的免疫学检测方法有电化学发光法、ELISA、酶联荧光免疫检测系统等，通常可在24小时内得到检测结果。其中临床应用最为广泛的是电化学发光法，具有操作简便、通量高等特点，但其操作过程需要专用的实验室和专业人员进行检测，操作步骤复杂，且检测时间较长，一般需要18?24小时。
[0006]免疫层析检测技术是ELISA技术原理的扩展应用。由于其简便、有效、廉价等优点，在目前的定点即时检测中的市场需求十分旺盛，基于此检测模式的各种标记分析方式还在不断被开发并应用到如蛋白检测、核酸检测、病毒学、细菌学等领域中。免疫层析技术是将免疫标记技术与层析技术结合起来的一种新型检测技术，可以利用标记物的显色特性，实现对待测物的定性、半定量、定量分析。它是以微孔滤膜为固相载体，以待测液为流动相，利用微孔滤膜的毛细作用及虹吸作用引导待测液体向前流动，同时待测液中的相关成分和固定在滤膜上的抗原或抗体发生反应，形成免疫复合物后，滞留在检测线上，通过对标记物颜色的深浅或荧光的光密度分析，从而得到直观的检测结果。在目前市场上流通的商业化免疫层析产品中，大都以胶体金颗粒作为标记物，因此又被称为胶体金免疫层析法。基于胶体金的免疫层析方法是市场上较为成熟的免疫层析产品，它是根据检测区域里检测线的显色情况来定性地判定检测样品中待分析物的有无；近来又开发了基于胶体金免疫层析方法的光学定量检测仪，它是根据检测线上显色的深浅对待分析物进行定量分析，但是这种检测仪只能捕获到膜表面1um左右厚度的光学信号，而对于膜深部的大部分信号检测不到，丢失了大部分的阳性信号，导致这种方法的灵敏度和准确性大大下降。
[0007]磁性免疫层析技术是以超顺磁性颗粒代替传统的标记物来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米颗粒上的目标物来提供对生物样本的定量检测数据，再利用被磁颗粒标记抗体所捕获的免疫复合物与磁信号之间的线性关系即可实现对生物样本的快速定量检测目的，此方法借助于磁强度检测仪来捕捉检测线上的磁信号强度，磁信号的捕捉不受膜厚度的影响，所有的阳性信号都能被检测，因而能大大提高检测的灵敏度和准确性。磁性免疫层析检测技术具有灵敏度高、稳定性强、线性范围宽、操作简便、快速等优点。
[0008]1、目前临床上检测CA72-4的方法主要是传统的免疫学检测方法，比如电化学发光法、ELISA、酶联荧光免疫检测系统，其操作过程需要专用的实验室和专业人员进行检测，操作步骤复杂，且检测时间较长，一般需要18?24小时，不适合对于癌症疾病人群的早期筛查。
[0009]2、在现有的快速检测方法中，尚无报道用免疫层析检测方法来检测机体血清中的肿瘤标记物CA72-4。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是利用免疫磁珠试纸条来准确地、快递地对肿瘤标记物CA72-4进行定量检测。本发明需要解决的技术问题有:一是实现将羧基纳米磁珠与抗CA72-4单克隆抗体偶联在一起作为纳米磁珠探针；二是确保试纸条上结合垫和样品垫的处理液成分能保证纳米磁珠探针在层析过程中能有效的发挥捕获抗原的作用，避免层析过程中的非特异性吸附现象，并在检测线上显示所有的阳性信号。
[0011]本发明提供一种检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背衬板，其特征在于，所述免疫磁珠试纸纸条所用的免疫层析法的类型为双抗夹心法，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次相互重叠地铺设在所述背衬板上，沿所述背衬板的长度方向各重叠部分的长度为0.5?2mm ;所述结合垫上设置有纳米磁珠探针，所述纳米磁珠探针包括羧基纳米磁珠和抗CA72-4单克隆抗体CC49 ;所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上设置有抗CA72-4单克隆抗体B72.3，所述质控线上设置有羊抗鼠二抗。
[0012]优选地，所述样品垫和所述结合垫均是玻璃纤维素膜，所述硝酸纤维素膜是pallvividl70o不同的硝酸纤维素膜，检测结果存在差异，商品化的pall vividl70具有较好的检测效果。
[0013]所述的检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:
[0014]步骤一，在酸性条件下，用EDC活化羧基纳米磁珠表面的羧基，并用NHS稳定活化的羧基，再在碱性条件下加入抗CA72-4单克隆抗体CC49，使得抗体Fab端的氨基与所述羧基纳米磁珠的活化的羧基相互连接形成酰胺键，进而将所述羧基纳米磁珠与所述抗CA72-4单克隆抗体CC49连在一起，得到所述纳米磁珠探针；
[0015]步骤二，将玻璃纤维素膜浸泡在含有蔗糖、海藻糖、TritonX-1OO的BS缓冲液中，润湿后，干燥获得所述结合垫，将步骤一得到的所述纳米磁珠探针固定到所述结合垫；
[0016]步骤三，将所述抗CA72-4单克隆抗体B72.3固定到所述检测线，将所述羊抗鼠二抗固定到所述质控线；
[0017]步骤四，将玻璃纤维素膜浸泡在含有NaCl、BSA、TritonX-100、PVP的BS缓冲液中，润湿后，干燥获得所述样品垫；
[0018]步骤五，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次相互重叠地铺设在所述背衬板上，沿所述背衬板的长度方向各重叠部分的长度为0.5?2mm，然后用自动切膜机切割以设定试纸条宽度，得到所述检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条。
[0019]优选地是，所述步骤一包括活化过程、偶联过程、封闭过程和保存过程，所述活化过程、所述偶联过程和所述封闭过程所使用的缓冲液中均不含表面活性剂，所述保存过程使用的缓冲液中含有表面活性剂。原因在于，为提高羧基磁珠与抗体之间酰胺键的偶联成功率，在封闭过程结束前的各步骤反应缓冲液中，均不含表面活性剂，封闭结束后的洗涤过程中，缓冲液中加入定量表面活性剂，提高洗涤效果，去除反应体系中多余的抗体及BSA，避免层析过程中的非特异性吸附现象。
[0020]其中，所述的表面活性剂为吐温20、吐温60或吐温80。
[0021]其中，I)所述活化过程是以pH 5.50.0lM的MES溶液作为活化缓冲液，取4mg/ml粒径约1nm的羧基纳米磁珠500ul于2ml离心管中，超声25?35min，18°C、13000rpm离心5min，弃上清后，取500ul所述活化缓冲液重悬附壁的磁珠，在漩涡振荡器上混合均匀，18°C、13000rpm离心5min，用所述活化缓冲液重复洗涤两次后，把磁珠重悬于500ul的所述活化缓冲液中，向磁珠溶液中加入4mgEDC固体粉末，振荡溶解后再加入4mg的NHS固体粉末，混合均匀，置于旋转混合器上，室温活化15