存备用。
[0053]步骤四:样品垫的处理
[0054]将玻璃纤维素膜(3cm*30cm)浸泡在含有2% NaCK0.5% BSA,0.05%聚乙二醇辛基苯基醚-1OO(TritonX-1OO)、0.2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.02M BS缓冲液中30分钟润湿后，28°C干燥I小时，封袋置于4°C保存备用。
[0055]步骤五:试纸条的组装
[0056]所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次相互重叠地铺设在所述背衬板上，沿所述背衬板的长度方向各重叠部分的长度约为1.5_。试纸条组装完成后，用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约3_，将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。
[0057]步骤六:定量检测标准曲线的获得及应用
[0058]取0、4、20、100、200、400U/ml的CA72-4标准品系列浓度梯度，分别用上述制备好的试纸条进行检测，待层析结束结果稳定后，用磁强度检测仪依次分析检测线上的磁信号强度。此步骤重复检测10次，相同抗原浓度下的10次磁强度检测结果取平均值作为最终磁强度结果，并以磁强度值作为Y轴，以抗原浓度作为X轴，可以得到一条正相关直线，并求出该曲线对应的二元一次方程式，该方程式即为本发明对糖蛋白CA72-4定量检测的标准曲线。在本发明的后期应用中，只需将检测样本在试纸条上层析后所得到的磁强度信号与标准方程对应，即可得到该检测样本里CA72-4的浓度。
[0059]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背衬板，其特征在于，所述免疫磁珠试纸纸条所用的免疫层析法的类型为双抗夹心法，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次相互重叠地铺设在所述背衬板上，沿所述背衬板的长度方向各重叠部分的长度为0.5?2mm ;所述结合垫上设置有纳米磁珠探针，所述纳米磁珠探针包括羧基纳米磁珠和抗CA72-4单克隆抗体CC49 ;所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，所述检测线上设置有抗CA72-4单克隆抗体B72.3，所述质控线上设置有羊抗鼠二抗。2.如权利要求1所述的检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条，其特征在于，所述样品垫和所述结合垫均是玻璃纤维素膜，所述硝酸纤维素膜是pall vividl70o3.如权利要求1或2任一项所述的检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一，在酸性条件下，用EDC活化羧基纳米磁珠表面的羧基，并用NHS稳定活化的羧基，再在碱性条件下加入抗CA72-4单克隆抗体CC49，使得抗体Fab端的氨基与所述羧基纳米磁珠的活化的羧基相互连接形成酰胺键，进而将所述羧基纳米磁珠与所述抗CA72-4单克隆抗体CC49连在一起，得到所述纳米磁珠探针； 步骤二，将玻璃纤维素膜浸泡在含有蔗糖、海藻糖、TritonX-1OO的BS缓冲液中，润湿后，干燥获得所述结合垫，将步骤一得到的所述纳米磁珠探针固定到所述结合垫； 步骤三，将所述抗CA72-4单克隆抗体B72.3固定到所述检测线，将所述羊抗鼠二抗固定到所述质控线； 步骤四，将玻璃纤维素膜浸泡在含有NaCl、BSA、TritonX-100, PVP的BS缓冲液中，润湿后，干燥获得所述样品垫； 步骤五，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次相互重叠地铺设在所述背衬板上，沿所述背衬板的长度方向各重叠部分的长度为0.5?2_，然后用自动切膜机切割以设定试纸条宽度，得到所述检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一包括活化过程、偶联过程、封闭过程和保存过程，所述活化过程、所述偶联过程和所述封闭过程所使用的缓冲液中均不含表面活性剂，所述保存过程使用的缓冲液中含有表面活性剂。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的表面活性剂为吐温20、吐温60或吐温80。6.如权利要求4或5任意一项所述的制备方法，其特征在于: 1)所述活化过程是以pH5.5 0.0lM的MES溶液作为活化缓冲液，取4mg/ml粒径约1nm的羧基纳米磁珠500ul于2ml离心管中，超声25?35min，18°C、13000rpm离心5min，弃上清后，取500ul所述活化缓冲液重悬附壁的磁珠，在漩涡振荡器上混合均匀，18°C、13000rpm离心5min，用所述活化缓冲液重复洗涤两次后，把磁珠重悬于500ul的所述活化缓冲液中，向磁珠溶液中加入4mgEDC固体粉末，振荡溶解后再加入4mg的NHS固体粉末，混合均匀，置于旋转混合器上，室温活化15?25min，得到产物一； 2)所述偶联过程是以pH8.8 0.005M的BS溶液作为偶联缓冲液，将所述活化过程中得到的所述产物一 18°C、12000rpm离心3min，去上清液，然后用所述偶联缓冲液500ul洗涤磁珠，18°C、12000rpm离心5min，去上清液，接着将磁珠重悬于470ul的所述偶联缓冲液中，再加入30ul 5mg/ml的抗CA72-4单克隆抗体CC49，混匀后置于37°C摇床中反应3小时，然后置于室温、旋转混合器上过夜，得到产物二 ； 3)所述封闭过程是将所述偶联过程得到的所述产物二18°C、12000rpm离心5min，用所述偶联缓冲液500ul重悬附壁磁珠，并称取0.025gBSA粉末溶于磁珠溶液中，溶解混匀后，置于旋转混合器上室温下封闭反应I小时，得到产物三； 4)所述保存过程是将所述封闭过程得到的所述产物三18°C、12000rpm离心3min，用含有0.05 %吐温20的pH8.8 0.005M的BST溶液洗涤磁珠，去上清液，得到所述纳米磁珠探针，将得到的所述纳米磁珠探针置于400ul含有0.05%吐温20的pH8.8 0.005M的BST溶液中，4°C保存。7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二是将玻璃纤维素膜浸泡在含有5%蔗糖、2%海藻糖、0.05% TritonX-1OO的0.02M BS缓冲液中30分钟，润湿后，28°C干燥I小时得到结合垫；.所述步骤一所得的所述纳米磁珠探针按照30cm/600ul的用量均匀喷涂在所述结合垫上，静置20min后，置于28°C恒温干燥箱干燥I小时，封袋置于4°C保存备用。8.如权利要求3?5或7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三是用0.0lMPH7.4的PBS缓冲液将所述羊抗鼠二抗稀释到lmg/ml，再添加2%的蔗糖作为质控线喷膜液；用0.0lM pH7.4的PBS缓冲液将所述抗CA72-4单克隆抗体B72.3稀释到2mg/ml，再添加2%的蔗糖作为检测线喷膜液；用喷膜机在所述硝酸纤维素膜上喷膜质控线与检测线，喷膜环境的温度控制在25°C，湿度40% -60%,喷膜速度0.5?2ul/cm，所述质控线与所述检测线之间间隔2?10mm，所述质控线的线条宽度与所述检测线的线条宽度为0.5?1.5mm，喷膜完成后，将得到的硝酸纤维素膜放在28°C恒温干燥箱干燥3小时，封袋置于4°C保存备用。9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三是用0.0lM pH7.4的PBS缓冲液将所述羊抗鼠二抗稀释到lmg/ml，再添加2%的蔗糖作为质控线喷膜液；用0.0lMPH7.4的PBS缓冲液将所述抗CA72-4单克隆抗体B72.3稀释到2mg/ml，再添加2%的蔗糖作为检测线喷膜液；用喷膜机在所述硝酸纤维素膜上喷膜质控线与检测线，喷膜环境的温度控制在25°C，湿度40% -60%,喷膜速度0.5?2ul/cm，所述质控线与所述检测线之间间隔2?10mm，所述质控线的线条宽度与所述检测线的线条宽度为0.5?1.5mm，喷膜完成后，将得到的硝酸纤维素膜放在28°C恒温干燥箱干燥3小时，封袋置于4°C保存备用。10.如权利要求1或2所述的检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条的应用方法，其特征在于: 步骤一，将待测样本加到所述样品垫上，通过层析作用所述待测样本会依次经过结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫； 步骤二，待层析结束结果稳定后，用磁强度检测仪检测分析所述检测线的磁信号强度和所述控制线的磁信号强度，实现肿瘤标记物CA72-4的定量检测。
【专利摘要】本发明提供一种检测肿瘤标记物CA72-4的免疫磁珠试纸条及其制备方法。所述试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背衬板，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次相互重叠地铺设在所述背衬板上，沿所述背衬板的长度方向各重叠部分的长度为0.5～2mm。所用的免疫层析法的类型为双抗夹心法，所用的两种抗体是抗CA72-4单克隆抗体CC49和抗CA72-4单克隆抗体B72.3。本发明所述的制备方法主要涉及纳米磁珠探针的制备。通过所述试纸条进行免疫层析后，用磁强度检测仪分析获得CA72-4的定量结果，方法简单、快速，且灵敏度和特异性均较高。
【IPC分类】G01N33/574, G01N33/577
【公开号】CN104931703
【申请号】CN201510371859
【发明人】王侃, 陈艳荣, 崔大祥, 何井华, 孙容瑾
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月29日