用于检测小麦矮腥黑粉菌的胶体金试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及小麦矮腥黑粉菌防治领域，具体涉及一种用于检测小麦矮腥黑粉菌的 胶体金试纸条。
【背景技术】
[0002] 小麦矮腥黑穗病是由小麦矮腥黑粉菌（TilletiacontroversaKUhn，TCK)引起的 重要国际检疫性病害，也是我国对外检疫的一类危险性植物病害。该病害危害大、防治难， 一旦传入会给小麦生产带来毁灭性危害，通常发病率约等于小麦产量损失率。据Hoffmann 报告，在流行年份，因TCK引起的损失率一般为20 %~50 %，最高可达75 %~90 %。除了 产量损失外，被侵染的小麦出粉率也会随着感染严重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子 而极大地影响品质。小麦矮腥黑粉菌对我国的小麦生产存在潜在危机，该病在栽培条件下 的主要寄主为冬小麦，我国常年小麦种植面积约2300万hm2,其中冬小麦占绝大部分，西 北、黄淮海等广大冬麦区均适合小麦矮腥黑粉菌的定殖和发生危害，随着我国加入WT0及 与TCK疫区国家-美国小麦贸易的增加，TCK传入我国的可能性日益增大，因此，必须加强 对小麦矮腥黑穗病进行检疫检测，为病害防治提供技术储备。
[0003] 目前对小麦矮腥黑粉菌的检测主要采用PCR方法，该方法通过设计小麦矮腥黑粉 菌的特异引物，以待测样品的DNA为模板，在严格的扩增条件下进行PCR反应，能够准确判 断待测样品中是否含有小麦矮腥黑粉菌。然而，该方法步骤繁琐，从取样到获得结果需要一 天时间，费时费力，并且需要在实验室内进行。因此，需要开发一种快速、简便、准确的检测 小麦矮腥黑粉菌的方法，可以随时检测待测植株是否感染了小麦矮腥黑粉菌，从而对小麦 矮腥黑穗病进行早期预警。
【发明内容】
[0004] 本发明根据上述领域存在的不足和需求，提供一种用于检测小麦矮腥黑粉菌的胶 体金试纸条及其检测方法，该方法适用于各种环境，操作简便易行，能够快速准确地判断待 测样品是否感染小麦矮腥黑粉菌。
[0005] 本发明请求保护的技术方案如下：
[0006] 抗小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 10883的杂交瘤细胞所分 泌。
[0007] 分泌抗小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.10883。
[0008] 用于检测小麦矮腥黑粉菌的胶体金试纸条，包括样品垫、金标垫、NC膜、吸水纸和 PS底板；所述样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸按样品层析方向依次设置于PS底板上；
[0009] 其特征在于：所述金标垫上包被有胶体金标记的权利要求1所述的抗小麦矮腥黑 粉菌的单克隆抗体；
[0010] 所述NC膜上按样品层析方向依次包括检测线和质控线，所述检测线上包被有灭 活的小麦矮腥黑粉菌孢子；所述质控线上包被有羊抗鼠二抗。
[0011] 所述金标垫上的抗体包被浓度为0. 096ug/cm。
[0012] 所述NC膜检测线上的抗原蛋白的包被浓度为1. 5mg/ml。
[0013] 所述NC膜质控线上包被的抗体为羊抗鼠二抗，其包被浓度为0.5mg/ml。
[0014]用于检测小麦矮腥黑粉菌的方法，其特征在于，采用权利要求3~6所述的胶体金 试纸条按照下列步骤进行检测：
[0015] (1)将待测样品滴加在样本垫上；
[0016] (2)待质控线显色后，观察检测线是否由无色变成红色；若检测线变成红色，则待 测样品中不含有小麦矮腥黑粉菌；若检测线不变色，则待测样品中含有小麦矮腥黑粉菌。
[0017] 本发明请求保护的抗小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体，其亚型为IgGl型，能够特异 识别小麦矮腥黑粉菌的孢子。该抗体由保藏号为CGMCC No. 10883的杂交瘤细胞所分泌，其 效价高、亲和力强、特异性好，与常见的小麦锈病无交叉反应，可用于检测样品是否含有小 麦矮腥黑粉菌。
[0018] 本发明还请求保护分泌抗小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏 号为 CGMCC No. 10883。
[0019] 本发明提供用于检测小麦矮腥黑粉菌的胶体金试纸条，包括样品垫、金标垫、NC 膜、吸水纸和PS底板，利用胶体金夹心法检测样品中是否存在小麦矮腥黑粉菌。其检测原 理为：样品滴加在样品垫上后，便朝着吸水纸的方向泳动，金标垫上胶体金标记的抗小麦矮 腥黑粉菌的单克隆抗体（金标抗体）溶解，若样品中没有小麦矮腥黑粉菌，那么当金标抗体 到达NC膜上的检测线时，金标抗体被检测线上包被的灭活的小麦矮腥黑粉菌孢子捕获，沉 积下来使检测线变成红色，多余的金标抗体继续向前泳动，被质控线上的羊抗鼠二抗捕获， 使质控线呈现红色。若样本中含有小麦矮腥黑粉菌，则金标抗体与小麦矮腥黑粉菌孢子结 合后向前泳动，越过检测线，在质控线上被羊抗鼠二抗捕获，使质控线呈现红色，而检测线 不变色。只有当质控线呈现红色时，该检测结果才有效。
[0020] 本发明还提供用于检测小麦矮腥黑粉菌的方法，该方法操作简单易行，只需将病 菌孢子用0. 02mol/l PBS缓冲液处理后，滴加在本发明试纸条的样本垫上，室温反应约 5-10min后，待质控线显色后，观察检测线是否由无色变成红色；若检测线变红，则表明待 测样品中不含有小麦矮腥黑粉菌或者待测植株未感染小麦矮腥黑粉菌；若检测线不变色， 则待测样品中含有小麦矮腥黑粉菌或者待测植株感染了小麦矮腥黑粉菌。采用本发明试 纸条进行检测，不需要仪器设备，在实验室和野外均可进行，从取材到获得检测结果仅需15 分钟，操作十分轻松，能够对小麦矮腥黑穗病进行早期预警，以便及时采取防治措施，大大 减少病害造成的损失。
[0021] 生物保藏信息：
[0022] 生物材料名称：TCK-2_2
[0023] 分类命名：对小麦矮腥黑粉菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株
[0024] 保藏日期：2015年06月05日
[0025]保藏号：CGMCC No. 10883
[0026] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0027] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所
【具体实施方式】
[0028] 以下通过具体实施例对本发明进行解释和说明，需要声明的是，下述实施例仅作 为举例说明，而不以任何方式限制本发明的范围。
[0029] 生物材料
[0030] 小麦矮腥黑粉菌：已知菌种，中国农业科学院植物保护研宄所麦类病害研宄组。
[0031] 叶锈菌THT:已知菌种，中国农业科学院植物保护研宄所麦类病害研宄组。试剂与 溶液：
[0032]HAuCL4(进口，sigma)，BSA(进口，巴斯夫或sigma)，PEG (20000)，二氯二甲硅烷 + 氯仿，各种普通化学药品，表面活性剂，缓冲溶液若干。
[0033] 标准品：黑粉菌孢子（浓度：1000ppm)
[0034] 主要材料仪器：
[0035] 划膜仪（biodot XYZ3060);胶体金颗粒（北京勤邦生物技术有限公司）；电磁加热 搅拌套式恒温器；洄流圆形烧瓶；蛇型冷凝管；搅拌子；分光光度计；高速冷冻离心机；烘 箱；切条机（biodot CM4000);除湿机；封口机；NC膜（whatman FF120);胶体金垫（聚醋膜 whatman);样品垫（玻璃纤维whatman，S2样品垫（处理液成分是：以0? 02mol/l PBS为母 液分别添加0.5% tween 20, 2%蔗糖，2% BSA);吸水纸、PS(国产进口皆可）。
[0036] 实施例1、小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体的获得
[0037] -、杂交瘤细胞的制备
[0038] 实验动物为BALB/c小鼠，由中国军事医学科学院提供。
[0039] 1、抗原制备
[0040] 用小麦矮腥黑粉菌孢子作为免疫原，按常规的小鼠免疫方法对小鼠进行免疫。
[0041] 2、制备杂交瘤细胞
[0042] (1)挑选小麦矮腥黑粉病血清检测较好的小鼠，进行加强免疫，同时准备SP2/0骨 髓瘤细胞，放在37°C二氧化碳培养箱中进行培养，加强免疫3天后进行融合。
[0043] (2)取已经免疫小麦矮腥黑粉菌的的BALB/c小鼠，通过颈脱位致死小鼠，浸泡于 75%酒精中5分钟。将小鼠取出晾干，放入超净工作台中，剪开外皮，暴露出腹腔的上皮，在 脾脏处将上皮剪开小口，取出脾脏，放入培养皿中，用注射器吸取不完全培养液，打到脾脏 里面，吹出脾细胞，如此反复，直至脾脏吹至透明为止。
[0044] (3)用吸管将SP2/0从瓶壁上吹下，再将SP2/0悬液全部移到上述脾细胞悬液中， 把离心管盖子拧紧。室温l〇〇〇r/min离心5min。离心好后倒掉上清，用吸水纸将流动液体 吸干，混匀细胞，加入融合剂，2分钟后缓慢加入不完全培养液进行终止融合。室温1000r/ min离心5min，弃掉上清，加入HAT培养液进行铺板培养。
[0045] (4)用间接酶联免疫吸附法检测融合细胞的阳性率，一共有6个孔对黑粉菌有阳 性反应，然后经有限稀释对检测出的6个孔的阳性杂交瘤细胞分别进行克隆，筛选得到1个 对黑粉菌阳性显色较高的细胞株，将其扩大培养并冻存。
[0046] 获得了稳定分泌抗小麦矮腥黑粉菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其细胞株编号 为：1E3,送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为：CGMCC No.10883。
[0047] 二、单克隆抗体制备
[0048] 1、采用体内诱生法大量制备单克隆抗体。
[0049] (1)制备腹水前注意观察，杂交瘤细胞（CGMCC No. 10883)生长饱满，状态良好，占 总体积的70%即可进行抗体制备。准备好离心管，用无菌的滴定管小心吹打细胞瓶底部，使 细胞从瓶底脱落，此动作重复10次左右，将吹好的细胞无菌转移至离心管内1000转/min 离心5min，小心将离心的上清倒掉，向离心管中加入DMEM，将细胞混匀，吸入注射器中，注 入已经注射石蜡油的小鼠体内。
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