专利名称：检测红霉素的胶体金试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测牛奶中红霉素残留的胶体金试纸条。
背景技术：
红霉素(Erythromycin A)属大环内脂类抗生素,对葡萄球菌、各种链球菌和革兰阳性杆菌均具有抗菌活性，应用非常广泛。红霉素在养殖业(畜禽、水产品)中主要用于细菌性疾病的治疗与防治。由于红霉素在动物体内代谢时间较长，因此不可避免地残留在动物体内，给食品安全带来危害。因此，红霉素类药物在畜禽及水产品生产上的大量使用会导致其在畜禽组织、蜂蜜、牛奶、鱼虾等产品中残留，危害公众健康。农业部第235号文件中已规定，该药物的最闻残留限量为200yg/kg。目前检测红霉素残留的测定方法主要有紫外法、液相色谱-荧光法、液相色谱-电化学法、液相色谱-质谱联用法、酶联免疫分析法、微生物方法和放射性免疫法。酶联免疫检测技术将酶联免疫反应与生物技术相结合用于食品中药物残留的检测，常以ELISA检测试剂盒的形式出现且易商品化，逐渐发展成为红霉素药物的残留含量检测中最实用的检测技术之一。胶体金免疫层析法与酶联免疫法相比检测时间更短，稳定性好、操作简便、无需其他仪器设备，结果判断直观可靠，适用于进行现场快速筛选。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测红霉素的胶体金试纸条。本实用新型的检测红霉素的胶体金试纸条，其包括冻干有红霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，所述反应膜上具有包被有红霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，检测线和质控线平行，均呈与试纸的长相垂直的条带状。质控线位于距离吸水垫始端与反应膜相连处5-8mm，检测线位于距离质控线5_6mm。试纸样品吸收垫为检测端，粘贴有保护膜，保护膜上有MAX标记线，微孔试剂上具有微孔塞，微孔试剂中冻干有红霉素单克隆抗体-胶体金标记物。为了便于运输和使用，胶体金试纸条盛装于具塞试剂桶中，试剂桶放置于具有固定用具的盒体中。本实用新型检测红霉素的胶体金试纸条中试纸底板为PVC底板；样品吸收垫为吸滤纸；吸水垫为吸水纸；反应膜为硝酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支撑材料；盒体为硬纸盒。本实用新型胶体金试纸条具有如下有益效果:1.显示检测结果形象、直观准确。检测时试纸以显示红色线“ I ”及“ Il ”印迹作为阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示在被检测样本液中红霉素含量高于或等于试纸条对红霉素的最低检测限，两条红线“ Il ”印迹表示在被检测样本中红霉素含量低于试纸条对红霉素的最低检测限，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不各易出现结果误判。2.灵敏度高。红霉素胶体金试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，其中的红霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。因此，本实用新型试纸条具有较高的特异性和灵敏度。本试纸条对牛奶中红霉素检测限为 10 μ g/Lo3.成本低，投资少。使用本实用新型的胶体金试纸条，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。4.易于大范围推广应用。本实用新型的胶体金试纸条操作简单，能较好满足牛奶检测的需求，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
图1为本实用新型试纸结构示意图；图2为本实用新型试纸俯视图；图3为本实用新型微孔试剂图；图4a、4b、4c、4d为本实用新型试纸检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定用具侧视图。
具体实施方式
一、红霉素胶体金试纸条的组装制备I)试纸样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫位于底板始端，吸水垫位于底板末端，样品吸收垫的末端与反应膜始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸样品吸收垫为检测端，粘贴有保护膜，保护膜上印有MAX标记线，检测线4包被有红霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。2)微孔试剂微孔试剂8具有微孔塞9，微孔试剂中冻干有红霉素单克隆抗体-胶体金标记物。3)将I)试纸和2)微孔试剂组装成胶体金试纸条，装入具有密封盖的塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于胶体金试纸条盒体12内的固定用具11中。二、胶体金试纸条的使用用微量移液器吸取待检牛奶样品溶液200 μ I滴加到微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀后，室温(20°C -25°C)孵育5min，将印有“MAX”线端朝下的试纸插入孵育后的微孔试剂后计时，室温孵育5min，观察结果。三、检测结果分析红霉素在样本中的含量高于或等于试纸条对其的最低检测限时，红霉素单克隆-胶体金标记物与红霉素结合，金标抗体上的抗原结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与红霉素半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在检测线和质控线上出现红色条带。如图4所示。阳性:当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸以显示红色线“ I ”，判为阳性，如图4a所示。阴性:当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带，试纸以显示红色线“ Il ”，判为阴性，如图4b所示。无效:当质控线(C)不显示红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸均判为无效，如图4c、4d所示。四、检测红霉素的胶体金试纸条中用到的材料制备方法1、红霉素半抗原-载体蛋白偶联物的合成与鉴定( I)红霉素半抗原的制备0.15 g红霉素在3 ml 二甲基亚砜(DMSO)中的混合物，60°C下缓慢滴加入0.1 ml1，3-丙二胺和0.1 ml吡啶在2 ml DMSO的混合液中，滴加完毕后，继续反应15小时，旋蒸除去溶剂和未反应的丙二胺，定量得到丙二胺单红霉素缩合物。(2)免疫原的制备取20mg红霉素半抗原用0.9ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解得到溶液I ;取0.1ml 10%的戊二醛加入溶液I中，室温搅拌反应8h得到溶液II ;取50mg牛血清白蛋白(BSA)用4ml 0.2mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液(CB)溶解完全得到溶液III ;将溶液II加入到溶液III中，反应24h ;加入25mg硼氢化钠反应2h ;用0.01mol/L的PBS透析三天,每天更换透析液三次，得到红霉素免疫原。(3)包被原的制备将BSA换成卵清白蛋白(OVA)按上述(2)的步骤制备得到红霉素包被原。2、红霉素单克隆抗体的制备(I)制备单抗a.动物免疫将步骤I得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为15(^g/只，使其产生
抗血清。[0046]b.细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞,按8:1 (数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选得到稳定分泌红霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。c.细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成6X IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37 °C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。d.单克隆抗体的制备与纯化[0051]增量培养法:将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、红霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备(I)胶体金的制备用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01% (质量百分含量)，取IOOml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)红霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入2(Γ50 μ g抗体的 标准向胶体金溶液中加入上述红霉素单克隆抗体，继续搅拌混匀IOminJPA 10%牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1% (体积百分含量)，静置lOmin。12000rpm, 4°C离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。复溶缓冲液:含牛血清白蛋白(BSA) 0.1°/Γθ.3% (体积百分含量)、吐温_800.059Γ0.2% (质量百分含量)、ρΗ7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。5、将红霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入50 μ I红霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50°C条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有红霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，将微孔试剂加上微孔塞，密封保存。6、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5%(体积百分含量))、pH为7.2,0.lmol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37°C烘2h备用。7、反应膜的制备包被过程:用磷酸缓冲液将红霉素半抗原-卵清白蛋白偶联物稀释到lmg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为1.0μ Ι/cm;用0.01mol/L、pH 7.4 PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200 μ g/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0 μ Ι/cm。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥16h，备用。
权利要求1.一种检测红霉素的胶体金试纸条，其特征在于试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成。
2.如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于所述反应膜上具有包被有红霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的胶体金试纸条，其特征在于所述检测线和质控线平行，均呈与试纸的长相垂直的条带状。
4.如权利要求1、2或3所述的胶体金试纸条，其特征在于所述样品吸收垫位于底板始端，所述吸水垫位于底板末端，所述质控线位于距离吸水垫始端与反应膜相连处5-8mm，所述检测线位于距离质控线5-6mm。
5.如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于所述试纸样品吸收垫为检测端，粘贴有保护膜，保护膜上有MAX标记线。
6.如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于所述底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，吸水垫为吸水纸，反应膜为硝酸纤维素膜，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于所述微孔试剂上具有微孔塞。
8.如权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于所述微孔试剂中冻干有红霉素单克隆抗体-胶体金标记物。
专利摘要本实用新型提供了一种检测红霉素的胶体金试纸条，试纸条包括微孔试剂和试纸，试纸由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，红霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，反应膜上具有包被有红霉素半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“︱”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“︱”。试纸条放置于具塞试剂桶中，12个具塞试剂桶放置于具有12个孔的固定用具的盒体中。本实用新型试纸条具有灵敏度高，检测时间短，便携性好等特点，可以在红霉素残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/577GK203069594SQ20122054038
公开日2013年7月17日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者万宇平, 冯才伟, 罗晓琴, 余厚美, 蒲小容, 冯才茂, 赵正苗, 罗贵昆 申请人:北京勤邦生物技术有限公司