作为癌症的标记物的Seprase的制作方法

专利名称：作为癌症的标记物的Seprase的制作方法
作为癌症的标记物的Seprase描述本发明涉及有助于评估癌症的方法。其公开了人成纤维细胞活化蛋白(FAP/ s印rase)作为不同癌症类型的通用标记物的用途。S印rase有助于评估与肺有关的癌症或 肺癌(LC)或结肠癌，例如非小细胞肺癌(NSCLC)或结直肠癌(CRC)，而且还可能有助于评估 其他特定类型的癌症。此类特定癌症类型是例如食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾 癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌。此外，其特别地涉及用于通 过测量来源于个体的液体样品中的s印rase来从所述样品评估癌症的方法。s印rase的测 量可以例如用于癌症的早期检测或用于经历手术的患者的监测。癌症仍然是主要的公共卫生挑战，尽管在检测和治疗上已取得进步。癌细胞以癌 症相关标记蛋白的产生为特征。在携带癌细胞的个体的组织和体液中都发现了癌症相关蛋 白。它们的水平在致癌性进展的早期通常很低，在疾病的进展过程中增加，并且只在极少的 情况下观察到蛋白在疾病进展过程中显示降低的水平。此类蛋白的灵敏检测是用于诊断癌 症(特别地在癌症的早期诊断中)的有利的和有前景的方法。最普遍的癌症类型是乳腺癌 (BC)、肺癌(LC)和结直肠癌(CRC)。用于实体瘤的最重要的治疗方法是a)肿瘤的手术切除，b)化学疗法，c)使用生物学如抗肿瘤抗体或抗血管生成抗体的疗法和d)上述方法的组合。肿瘤的手术切除已被广泛接受为早期实体瘤的一线疗法。然而，大多数癌症只有 当它们显示症状，即当患者已处于疾病进展的相当晚期时才被检测到。癌症的分期是根据程度、进展和严重度对疾病的分类。其将癌症患者分类，这样可 对治疗的预后和选择进行归纳。按照Duke的分期A至D将CRC的不同分期用于分类。今天， Μ系统是最为广 泛使用的癌症的解剖学范围的分类。其代表了国际上接受的统一的分期系统。存在3个 基本变量T(原发性肿瘤的范围)、Ν(区域淋巴结的状态)和M(远端转移的存在或不存 在)。TNM 标准由 UICC (国际防癌联盟(International Union Against Cancer)), Sobin, L. H. ， ffittekind, Ch. (eds) :TNM Classification of Malignant Tumours,H 6 IK,2002) 公布。一旦 Μ状态被确定，患者则被分类至由范围从I至IV(IV是最晚期疾病的分期) 的罗马数字表示的疾病分期。
Μ分期和UICC疾病分期彼此相应，如取自Sobin L.H.和 ffittekind (eds.)(同上)的下表中所示的。TW分期与UICC疾病分期的相互关系
尤其重要的是癌症例如CRC的早期诊断转变为好得多的预后。在CRC中，结肠直肠 的恶性肿瘤起于良性肿瘤，即来自腺瘤。因此，最佳预后使患者在腺癌期被诊断。早在Tis、 NO、MO或T1-3 ；NO ；MO期被诊断的患者，如果经适当治疗，与对于当远端转移已存在时诊断 的患者只有10%的5年存活率相比较，在诊断后具有90%以上的机会存活5年。目前的检测方法(包括成像方法，例如X射线或核共振)在理论上可能至少部分 适合用作一般筛查工具。然而，它们极其昂贵，因而对于卫生保健系统来说不能承担其在大 量受试者(特别对于无任何肿瘤症状的受试者)的普查中普遍和广泛的使用。因此，本发明的目的是提供简单且成本效率的肿瘤评估方法，例如以鉴定怀疑患 有癌症的个体。为此目的，可在体液例如血液或血清或血浆中检测到的一般肿瘤标记物或 一组此类标记物将是令人期待的。许多血清肿瘤标记物已用于临床应用。例如cytoceratin 19的可溶性30kDa 片段(CYFRA 21-1)、癌胚抗原(carcinoembryogenic antigen) (CEA)、神经元特异烯醇 化酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最突出的LC标记物。然而，它们中没有一个 满足筛查工具所需的灵敏度和特异性标准(Thomas，L.，Labor和Diagnose (2000) TH BooksVerIagsgese1lschaft, Frankfurt/Main, Germany)。为了具有临床效果(clinical utility)，作为单个标记物的新型诊断标记物应当 可与本领域内已知的其他标记物相当，或更好。或者，如果分别地将新型标记物单独使用或 与一个或更多个其他标记物组合使用，其应当导致诊断灵敏度和/或特异性的提高。最好 通过其受试者工作特性(将在下面进行详细地描述)评估检测的诊断灵敏度和/或特异 性。全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。可有助于可靠的癌 症检测或提供早期预后信息的早期肿瘤标记物的鉴定可导致可大大促进该疾病的诊断和管理的方法。因此，存在提高癌症，特别地LC的体外评估的紧迫临床需要。提高癌 症例如LC的早期诊断尤其重要，因为对于早期诊断的患者，存活的机会与在疾病的晚期 (progressedstage)诊断的患者相比要高得多。最近已对肺癌中生物化学标记物的临床功用进行了综述。(Duffy，M. J. ,Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38(2001)225-262)。CYFRA 21-1目前被认为是当前已知的肺癌肿瘤标记物中最好的标记物。即使这 样，也未在肺组织中显著地发现其器官特异性。CYFRA 21-1对于肺癌的灵敏度在95%的针 对其他良性肺病的特异性下被描述为在46至61%之间。增加的CYFRA 21_1血清水平还与 明显的良性肝疾病、肾功能不全和浸润性膀胱癌相关。CYFRA 21-1检测被推荐用于术后治 疗监测。CEA属于胎儿癌性抗原类群，通常在胚胎发生过程中产生。CEA不是器官特异性的 并且主要用于结直肠癌的监测。除了恶性肿瘤外，还有几种良性疾病例如肝硬化、支气管 炎、胰腺炎和自身免疫疾病与增加的CEA血清水平相关。在对于良性肺疾病95%的特异性 下，其对于肺癌的敏感度据报导为29-44%。CEA的优选用途是肺癌的治疗监测。NSE是SCLC的肿瘤标记物。通常，发现增加的NSE血清水平与神经外胚层和神经 内分泌瘤相关。还在患者中发现增加的血清水平与良性肺病和脑病例如脑膜炎或脑的其他 炎性疾病以及对头的跌打损伤相关。虽然对于SCLC (在95%的特异性下)的灵敏度据报导 为60-87%，但对于NSCLC，NSE的性能较差(7-25%的灵敏度)。NSE被推荐用于SCLC的治 疗监测。关于标记物特征和针对提高的肺癌的诊断，公布了使用基于模糊逻辑学的分类算 法来组合CYFRA 21-1、NSE和C反应蛋白(CRP)(其为一般炎症标记物)的血清水平的方 法(Schneider, J.，等人，Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)。作者报导了在 95% 的特异 性下的92%的灵敏度。然而，在该研究中，例如CYFRA 21-1作为单个肿瘤标记物的灵敏度 据报导在95%的特异性下为72%，这比在许多其他报导的研究中报导的显著更高。Duffy， Μ. J. , in Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225_262才艮导了 46%至61%的灵敏度。由Schneider等人获得的该异常高的性能引起了一些怀疑，其可能 由于几个因素造成。第一，对照患者群体似乎比患者群体更年轻，即群体年龄不十分匹配， 并且患者群体包括许多晚期分期。第二且更至关重要地，在用于模糊逻辑限定词的确定的 训练集的样品上检查算法的性能。因此，这些限定词严格来说是针对该集“特制的”并且不 用于独立的验证集。在正常情况下，势必期望用于更大的、独立的且充分平衡的验证集的相 同算法将导致显著降低的总体性能。本发明的任务是调查是否可鉴定可用于评估癌症疾病的生物化学标记物。特别 地，本发明的发明者调查是否可在体液中鉴定用于评估不同癌症类型例如肺癌、乳腺癌、结 肠癌、前列腺癌和肾癌的生物化学标记物。在本发明的非常优选方面，调查了用于肺癌(LC) 或结直肠癌(CRC)的评估的生物化学标记物的鉴定。令人惊讶地，已发现标记物s印rase的使用可至少部分地克服现有技术中目前已 知的标记物的一些问题。本发明涉及用于体外评估癌症的方法，其包括测量样品中seprase多肽和/或其 片段的浓度和/或活性以及将测量结果，特别地测定的浓度和/或活性用于癌症的评估中。
令人惊讶地，发现受试样品中减少的s印rase多肽和/或其片段的浓度和/或活 性与癌症的风险和/或发生相关。还发现seprase是对于单一类型的癌症无特异性但为许 多类型癌症的标记物(即，一般肿瘤标记物)的标记物。因为s印rase对致瘤过程表现出 相当的特异性，因此新型肿瘤标记物对于不同种类的肿瘤类型具有潜在的临床效果。本发明的方法适用于评估许多不同类型的癌症。已例如分别在特定的癌症类型如 肺癌、结肠癌、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱 癌、子宫内膜癌和前列腺癌中发现，与正常对照相比较，样品中seprase或其片段的浓度和 /或活性减少。根据本发明的优选实施方案，为了体外评估特定癌症类型例如肺癌、结肠癌、食道 癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和 前列腺癌，测量样品中seprase的浓度和/或活性。根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌、结肠癌、食道 癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌，测量样品中seprase的浓度和/或活性。根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌、结肠癌、食道 癌、头颈癌、胃癌或胆管癌，测量样品中seprase的浓度和/或活性。根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌(LC)或结直肠 癌(CRC)，测量样品中s印rase的浓度和/或活性。根据本发明的另一个优选实施方案，为了体外评估癌症例如肺癌(LC)，测量样品 中s印rase的浓度和/或活性。本发明的一个实施方案涉及区分可能不患癌症的个体与可能被分类为“疑似”病 例的个体的人群的普查。然后可以例如利用成像方法或其他合适的方法使后一个个体群体 经历进一步的诊断过程。本发明的另外的实施方案涉及适合于诊断一般性癌症的肿瘤标记物组或适合于 诊断特定肿瘤类型例如肺癌或结肠癌的肿瘤标记物组的改进。本发明还涉及用于利用生物化学标记物体外评估癌症的方法，其包括测量样品中 seprase和特异于癌症的一个或更多个其他标记物的浓度和/或活性，以及将测量结果，特 别地测定的浓度用于癌症的评估。与seprase组合使用的优选标记物在另一个方面是为一 般性肿瘤标记物(即不特异于单个肿瘤类型的标记物)的标记物或，在另一方面，是为特定 肿瘤的标记物(为特异于单个肿瘤类型的标记物)的标记物。例如用于癌症例如肺癌或 结肠癌的评估的优选标记物是 Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。此类标记物可各自单个地使用或以任何组合与s印rase —起使用。如果，根据本发明的方法，评估癌症，则各癌症的一个或更多个其他标记物优选选 自 Cyfra 21—1、CEA、NSE、CA19—9、CA125、PSA、ASC、S100A12 禾口 NNMT。因此，在优选实施方案中，本发明还涉及包括标记物s印rase和例如Cyfra 21-1, CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12和NNMT中的至少一个其他肿瘤标记物的标记 物组在评估癌症例如肺癌和/或结肠癌中的用途。优选，本发明涉及用于利用生物化学标记物评估癌症例如肺癌或结肠癌的方法， 其包括测量样品中seprase和/或其片段以及一个或更多个其他癌症标记物，例如肺癌或 结肠癌的一个或更多个其他标记物的浓度和/或活性，以及将测量结果，特别地测定的浓
7度用于癌症评估中。优选，一个或更多个其他标记物选自Cyfra 21_1、CEA、NSE、CA19_9、CA 125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。在优选实施方案中，本发明还涉及包括至少s印rase和CYFRA 21-1的标记物组在 评估癌症，特别地LC或结肠癌以及更特别地NSCLC或结直肠癌中的用途。本发明还涉及包括至少s印rase和CEA的标记物组用于评估癌症，特别地LC或结 肠癌，以及更特别地NSCLC或结直肠癌的用途。本发明还涉及包括至少s印rase和SCC的标记物组用于评估癌症，特别地LC或结 肠癌，以及更特别地NSCLC或结直肠癌的用途。本发明还涉及s印rase多肽和/或其片段在评估癌症中的用途，其中减少的 seprase和/或其片段的浓度和/或活性预示着癌症。本发明还涉及s印rase在评估几种特定类型的癌症，特别地肺癌、结肠癌、食道 癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和 前列腺癌中的用途。本发明还涉及抗s印rase多肽和/或其片段的抗体在评估癌症中的用途，其中减 少的seprase和/或其片段的浓度和/或活性预示着癌症。本发明还涉及用于测量seprase多肽和/或其片段的酶促活性的试剂在评估癌症 中的用途，其中减少的seprase和/或其片段的浓度和/或活性预示着癌症。本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异性测量 seprase多肽和/或其片段和一个或更多个其他癌症标记物所需的试剂。本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少特异地测量 seprase和一个或更多个癌症标记物(例如上述肺癌、结肠癌、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管 癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌的标记物)所 需的试剂，其中其他标记物可各自单个地使用或以其任何组合使用。本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别特异性地 测量seprase和CYFRA 21-1所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别地特异性 地测量s印rase和CEA所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。本发明还提供了用于进行根据本发明的方法的试剂盒，其包括至少分别特异性地 测量seprase和SCC所需的试剂和任选地用于进行测量的辅助试剂。在优选实施方案中，本发明涉及用于体外评估癌症的方法，其包括测量样品中(a) seprase多肽和/或其片段，(b)任选地一个或更多个其他癌症标记物的浓度和/或活性， 和(c)将步骤(a)和任选地步骤(b)的测量结果用于癌症的评估，其中减少的s印rase和 /或其片段的浓度和/或活性预示着癌症。术语“测量”优选包括样品中seprase多肽的定性、半定量或定量测量。在优选实 施方案中，测量是半定量测量，即，确定s印rase的浓度和/或活性是高于还是低于截止值 (cut-off value) 0如本领域技术人员将理解的，在是_(存在)或否_(不存在)测定中， 通常将测定灵敏度设置至匹配截止值。可以例如根据健康个体组的检测来确定截止值。优 选地，将截止值设置至导致90 %的特异性，还优选地将截止值设置至导致95 %的特异性， 或还优选地将截止值设置至导致98%的特异性。低于截止值的值可以例如预示癌症的存在。特别地低于截止值的值可以例如预示着肺癌、结肠癌、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰 腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌的存在。在另外的优 选实施方案中，seprase的测量是定量测量。在另外的实施方案中，seprase的浓度和/或 活性与基本诊断问题如例如疾病的分期、疾病进展或对治疗的反应相关。人wprase(别名成纤维细胞活化蛋白(FAP))是170kDa的具有明胶酶和二肽 基肽酶活性的膜结合糖蛋白。其由两个相同的单体单位(UniProt KB数据库，登录号 P 27487)(特征在于SEQ ID N0:1(图3)中给定的序列)组成。S印rase单体包含766 个氨基酸并且具有97kDa(SDS-PAGE)的表观分子量(Pineiro-Sanchez等人，J.Biol. Chem. 272(1997)7595-7601 ;Park 等人，J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512)。seprase 的可溶性形式是抗纤溶酶切割酶(antiplasmin-cleaving enzyme) APCE (Lee等人，Blood 103 (2004) 3783-3788 ；Lee 等人，Blood 107 (2006) 1397-1404)。APCE 的 N 末端氨基酸序列 相应于s印rase的残基24至38，预测其在成纤维细胞细胞质内具有前6个N末端残基，接 着是20个残基的跨膜结构域，然后是734个残基的细胞外C末端催化结构域(Goldstein 等人，Biochim. Biophys. Acta. 1361 (1997) 11-19 ；ScanIan 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(1994)5657-5661)。Pineiro -Sanchez等人(同上)发现增加的s印rase的表达与人黑色素瘤和癌细 胞的侵袭性表型相关。Henry等人，Cl in. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741描述了具有高水 平的间质s印rase的人结肠肿瘤患者更可能具有侵袭性疾病进展以及转移或复发的潜在 发展。因此，本领域的上述文献中没有一个表明体液中减少的seprase多肽和/或其片 段的浓度和/或活性预示着癌症。令人惊讶地，在本发明中发现体液中s印rase多肽和/或其片段的，特别地APCE 的浓度和/或活性例如酶促活性的确定使得能够评估癌症例如肺癌、结肠癌、食道癌、头颈 癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺 癌。甚至更令人惊讶地，发现与正常对照相比较，样品中减少的s印rase或其片段的浓度和 /或活性预示着癌症的风险或发生。如本文中所使用的，每一个下列术语在该部分中具有与其相关的意义。冠词“a”和“an”在本文中用于指一个或更多个(即，至少一个)冠词的语法宾语。 例如，“a标记物”意指一个标记物或更多个标记物。术语“至少”用于表示任选地一个或更 多个另外的物体可存在。例如，包括至少(标记物)s印rase和CYFRA 21_1的标记物组可 任选地包括一个或更多个其他标记物。表述“一个或更多个”表示1至50，优选1至20，还优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12
或15。本文中使用的术语“标记物”或“生物化学标记物”是指被用作靶以分析患者的受 试样品的分子。此类分子靶的实例是蛋白质或多肽。在本发明中用作标记物的蛋白质或多 肽预期包括所述蛋白质的天然发生的变体以及所述蛋白质或所述变体的片段，特别地免疫 学可检测片段。免疫学可检测片段优选包括所述标记物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20 个连续氨基酸。本领域技术人员认识到由细胞释放的或存在于细胞外基质中的蛋白质可在 例如炎症期间被破坏，并且可开始降解或被切割成这样的片段。某些标记物以无活性的形
9式合成，所述形式随后可通过蛋白质水解激活。如本领域技术人员将理解的，蛋白质或其片 段还可作为复合物的部分存在。这样的复合物在本发明的意义上也可用作标记物。标记物 多肽的变体由相同基因编码，但作为备选的mRNA或pre-mRNA剪接的结果，可在它们的等电 点(=PI)或分子量(=MW)或两者上不同。变体的氨基酸序列与相应的标记物序列达到 95%或更多的同一。此外，或备选地，标记物多肽或其变体可具有翻译后修饰。翻译后修饰 的非限定性实例是糖基化、酰基化和/或磷酸化。Seprase 根据本发明，术语“S印rase多肽和/或其片段”是指单体或多聚体，特别地二聚 体多肽。此外，术语“S印rase多肽和/或其片段”特别地指s印rase和/或其片段的可溶 性形式，特别地抗血纤溶酶切割酶(APCE)以及指以与另一种多肽的复合物的形式存在的 seprase 禾口 / 或 seprase 片段。优选在适当的样品，特别地体液中检测S印rase多肽，特别地s印rase多肽和/或 其片段的可溶性形式。优选样品是体液例如血液、血浆、血清、痰、尿、粪便等。优选，样品来 自人受试者，例如肿瘤患者或处于肿瘤的风险中的人或怀疑患有肿瘤的人。根据本发明，测定seprase多肽和/或其片段的浓度和/或活性。在一个实施方 案中，通过使用特异性结合剂从样品特异性地测量标记物。特异性结合剂是例如s印rase的受体、结合s印rase的凝集素或抗s印rase的抗 体。特异性结合剂对于其相应的靶分子具有至少IO7Vmol的亲和力。特异性结合剂优选 对于其靶分子具有IO8Vmol或也优选IO9Vmol的亲和力。如本领域技术人员将理解的，术 语特异性用于表示存在于样品中的其他生物分子不显著结合特异于seprase的结合剂。优 选，对除了靶分子外的生物分子的结合水平分别导致至多仅为10%或更少，仅为5%或更 少，仅为2%或更少或仅为或更少的对于靶分子的亲和力的结合亲和力。优选特异性结 合剂将满足上述关于亲和力以及特异性的最低标准。特异性结合剂优选是与seprase反应的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆 抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及指包含抗体的结合结构域的基因构建体。可使用保持特异性结合剂的上述标准的任何抗体片段。通过现有技术方法，例如， ^PITijssen, P. , Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B. V. , Amsterdam, the whole book，特别地第 43 至 78 页中描述的方法，产生 抗体。此外，本领域技术人员十分了解基于可用于抗体的特异性分离的免疫吸附剂的方法。 通过此类方法，可提高多克隆抗体的质量，从而增强它们在免疫测定中的性能。(Tijssen， P.，同上，第108至115页)。为了达到本发明中公开的成就，可使用在兔子中产生的多克隆抗体。然而，也很显 然，还可使用来自不同物种例如大鼠或豚鼠的多克隆抗体以及单克隆抗体。因为单克隆抗 体可以以任何需要的量和恒定的性质产生，它们代表了用于临床常规测定的开发的理想的 工具。在根据本发明的方法中抗seprase的单克隆抗体的产生和应用分别代表了其他优选 实施方案。适合于检测s印rase的抗体的优选实例公开于Pifieiro-Sdnchez等人，同上，例 如抗体D8、D28和D43。正如本领域技术人员现将认识到s印rase已被鉴定为用于评估癌症优选肺癌或 结肠癌的标记物。不同的免疫诊断方法可用于获得可与本发明的成就相当的结果。例如，可使用产生抗体的备选策略。这样的备选策略包括除其他以外，合成肽的使用、提供seprase 的表位以进行免疫。备选地，可使用也称为DNA疫苗接种的DNA免疫。为了进行测量，将获自个体的样品在适合于结合剂seprase复合物形成的条件下 与s印rase的特异性结合剂一起温育。这样的条件不必详细说明的，因为本领域技术人员 无需任何发明努力就可容易地鉴定这样的合适的温育条件。在癌症优选肺癌的评估中测量 和使用结合剂seprase复合物的量。本领域技术人员将理解，存在许多测量特异性结合剂 seprase复合物的量的方法，其全都详细地描述于相关教科书(参见，例如，Ti jssen，P.，同 上，或 Diamandis, E. P.,禾口 Christopoulos, T. K. (eds. ), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))中。优选，在夹心类型测定形式中检测seprase。在这样的测定中，将第一特异性结合 剂用于将seprase捕获在一侧，并且将经标记可被直接或间接检测的第二特异性结合剂用 于另一侧。用于夹心类型测定形式的特异性结合剂可以是特异性抗seprase抗体。在一方 面，可通过使用不同的捕获和标记抗体(即，识别s印rase多肽上的不同表位的抗体)进行 检测。在另一个方面，还可使用抗s印rase的相同表位的捕获和标记抗体进行夹心类型测 定。在该实施方案中，只有seprase的二聚体和多聚体形式可被检测到。根据本发明的另外的实施方案，通过使用适合于检测seprase的酶促活性的检测 方案来从样品特异性地测量标记物s印rase。酶促活性可以例如是明胶酶活性或肽酶活性。 可以例如使用明胶酶的酶谱，通过酶谱法来测定明胶酶活性。可以例如，使用肽底物，通过 荧光测定法来测定肽酶活性。用于测量seprase活性的测定法由例如Lee等人(2006)(同 上)描述。在本发明的意义上“癌症的标记物”和特别地“肺癌的标记物”以及“结肠癌的标 记物”是如果与标记物s印rase组合可在癌症的评估中，例如在一般性癌症的评估中或在某 些癌症类型的评估中(例如在LC或CRC的评估中)增加相关信息的任何标记物。如果可 通过将所述标记物包括入已包含标记物s印rase的标记物组合来分别提高对于癌症评估 的敏感度(在给定的特异性下)或特异性(在给定的灵敏度下)，则信息被认为是相关或为 相加值(additive value) 0在优选癌症评估的实施方案中，灵敏度或特异性的提高分别地 在ρ = . 05、. 02、. 01或更低的显著性水平上是统计学上显著的。优选，一个或更多个其他 肿瘤标记物选自 CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA 19-9, CA 125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。本文中使用的术语“样品，，是指获得用于体外评估目的的生物样品。在本发明的 方法中，样品或患者样品优选可包括任何体液。优选样品是全血、血清、血浆、支气管灌洗物 (bronchial lavage)或痰，血浆或血清是最优选的。术语“评估癌症”和特别地“评估肺癌”或“评估结肠癌”用于表示根据本发明的方 法将(单独地或与其他标记物或变量，例如由UICC所示的标准(参见上文)一起)例如帮 助医师确定或确认癌症特别地LC或CRC的不存在或存在或帮助医师预后、检测复发(术后 患者的随访)和/或监测治疗特别地化学治疗。如本领域技术人员将理解的，任何此类评估是在体外进行的。之后弃去患者样品。 患者样品只用于本发明的体外诊断方法，并且不将患者样品的材料转移回患者体内。通常， 样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。在优选实施方案中，本发明涉及用于利用生物化学标记物评估癌症例如LC或CRC的方法，其包括测量样品中seprase的浓度和将测定的浓度和/或活性用于癌症例如LC或 CRC的评估。本发明的发明者已令人惊讶地能够在显著百分比的来源于患有癌症特别地患有 肺癌、结肠癌、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱 癌、子宫内膜癌和前列腺癌的患者的样品中检测到减少的标记物seprase的浓度和/或活 性。更令人惊讶地，他们已能够证明获自个体的此类样品中减少的s印rase的浓度和/或 活性可用于癌症特别地上述癌症疾病的评估。进行诊断的理想的情形是其中单个事件或过程可在例如感染性疾病中引起各自 疾病的情形。在所有其他情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学未完全弄 清楚时，对于许多癌症类型例如对于LC的情况就是如此。如本领域技术人员将理解的，不 存在对于给定的多因子疾病例如LC的诊断既具有100%的特异性同时又具有100%的灵敏 度的生物化学标记物。相反，生物化学标记物例如CYFRA 21-1、CEA、NSE，或如本文中所显 示的seprase可用于以某种可能性或预测值例如存在、不存在或严重度来评估疾病。因此 在常规临床诊断中，通常在潜在的疾病的诊断、治疗和管理中同时考虑不同的临床症状和 生物学标记物。可以单个地测定生物化学标记物或在本发明的优选实施方案中使用基于芯片或 珠粒的阵列技术同时测量它们。然后例如使用各标记物的个体截止值独立地解释生物标记 物的浓度，或将它们组合以进行解释。在另外的优选实施方案中，在方法中进行根据本发明的癌症的评估，所述方法包 括测量样品中a) seprase多肽和/或其片段，和b) —个或更多个其他癌症标记物的浓度和 /或活性，以及c)将测量结果，例如分别在步骤(a)和步骤(b)中测定的浓度用于癌症的评 估。在癌症的评估中，标记物seprase在一个或更多个下列方面中是有利的筛查；诊 断帮助；预后；治疗例如化学治疗、放射治疗和免疫治疗的监测。筛查筛查定义为就疾病的指标，例如癌症的存在鉴定个体例如处于风险中的个体的检 测的系统性应用。优选筛查群体由已知处于比平均水平更高的癌症风险中的个体组成。例 如，肺癌的筛查群体由已知处于比肺癌的平均风险更高的风险中的个体(如吸烟者、曾吸 烟者(ex-smoker)和暴露于铀、石英和石棉的工人)组成。在优选实施方案中，体液例如血清或痰在癌症例如肺癌或结直肠癌的筛查中用作 样品。对于许多疾病，循环中没有单个生物化学标记物可以总是满足筛查目的所需的灵 敏度和特异性标准。这对于癌症，特别地肺癌似乎也是如此。势必期望必须将包括多个标记 物的标记物组用于癌症的筛查。本发明中确定的数据表明标记物s印rase将形成适合用于 筛查目的的标记物组的构成整体所必需的(integral)部分。本发明因而涉及s印rase作 为癌症标记物组(即包括seprase和一个或更多个另外的用于癌症筛查目的的标记物的标 记物组)的一个标记物的用途。特别地，本发明涉及s印rase作为一般性癌症标记物组中 的一个标记物的用途。这样的标记物组包括标记物s印rase和一个或更多另外的标记物， 例如一般性癌症标记物和/或用于上述类型的癌症的标记物。
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Seprase还可能贡献于用于某些特定类型癌症例如肺癌、结肠癌、食道癌、头颈癌、 胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌的 标记物组。使用包括s印rase的标记物组评估的其他优选类型的癌症是肺癌、结肠癌、食道 癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌。使用包括s印rase的标记物组评估的其他优选类型的癌症是肺癌、结肠癌、食道 癌、头颈癌、胃癌、胆管癌。使用包括s印rase的标记物组评估的其他优选类型的癌症是肺癌、结肠癌。使用包括s印rase的标记物组评估的优选类型的癌症是肺癌(LC)。本数据还表明标记物的某些组合在癌症的筛查中是有利的。例如，参考筛查LC 或CRC的优选实施方案，本发明还涉及包括s印rase和CYFRA 21-1的标记物组、或包括 s印rase和CEA的标记物组、或包括s印rase和NSE的标记物组、或包括s印rase和CA 19-9 的标记物组、或包括s印rase和CA 125的标记物组、或包括s印rase和PSA的标记物组、或 包括s印rase和ASC的标记物组、或包括s印rase和S100A12的标记物组、或包括s印rase 和NNMT的标记物组、或包括s印rase和两种或更多种选自CYFRA 21-1, CEA,NSE, CA 19-9, CA 125，PSA, ASC, S100A12和NNMT的标记物组的用途。诊断辅助物标记物可以有助于特定器官中良性对恶性疾病的鉴别诊断，帮助区分不同的组织 学类型的肿瘤或在手术前建立基线标记物值。当今，用于检测癌症的重要方法是放射学和/或计算机断层(CT)扫描。可通过 这些方法显现小瘤(Small nodule)即可疑组织的小区域。然而，许多此类小瘤_90%以上 (通过CT)-代表良性组织变化，只有少数小瘤代表癌性组织。标记物s印rase的使用可有 助良性对恶性疾病的区分。因为作为单个标记物的s印ras可能优于其他标记物，例如在LC的情况下优于其 他标记物，如CEA或NSE，因此势必期望将s印rase用作诊断辅助物(特别地通过在手术前 确定基线值)。本发明因此还涉及seprase用于在癌症的手术之前确定基线值的用途。预后预后指标可定义为以一定的可能性预测疾病结果的癌症患者和它们的肿瘤的临 床、病理学或生物化学特性。它们的主要用途是帮助合理地计划患者管理，即分别避免对侵 袭性疾病的处理不足和对怠惰性疾病(indolent disease)的治疗过度。Molina，R.，等人， Tumor Biol. 24(2003)209-218 评估了 CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC 和 NSE 在 NSCLC 中的 预后价值(prognostic value) 0在他们的研究中，标记物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的 异常血清似乎表示更短的存活时间。由于S印rase单独地显著促进癌症患者例如LC或CRC患者与健康对照的区分，因 此必需期望其将有助于评估患有癌症优选患有LC或CRC的患者的预后。将最可能把术前 seprase的水平与一个或更多个其他癌症标记物和/或TNM分期系统组合。在优选实施方 案中，seprase用于患有LC或CRC的患者的预后。化学治疗的监测Merle，P.，等人，Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315 已评估了用诱导化疗法治疗的患有局部晚期NSCLC的患者中CYFRA 21_1血清水平的变化。他们得出 CYFRA 21-1血清水平的早期监测可以是III期NSCLC患者中肿瘤反应和存活的有用的预 后工具。此外，报告已描述了 CEA在监测患有LC的患者的治疗中的用途(FukasawaJ.，等 人，Cancer & Chemotherapy 13 (1986) 1862-1867)。大多数此类研究是基于回忆的、非随机 化的并且包括少数患者。如在使用CYFRA 21-1的研究的情况下，CEA研究表明a)CEA水平 降低同时接受化学治疗的患者通常具有比其CEA水平未能降低的患者更好的结果以及(b) 对于所有患者，CEA水平的增加与疾病的进展相关。预期s印rase将是分别与CYFRA 21-1或CEA至少一样好的用于化学治疗的监测 的标记物。本发明因此还涉及s印rase在监测处于化学治疗中的癌症患者，优选肺癌(LC) 或结肠癌(CRC)患者中的用途。在一个优选实施方案中的治疗监测中，可将对于s印rase 的测量与对于至少一种选自CYFRA 21-1、CEA和/或NSE的标记物的测量组合，然后将其用 于肺(LC)癌的评估。随访大部分经历目的在于完全清除癌性组织的手术切除的LC患者日后发生复发性 或转移性疾病(Wagner，H.，Chest 117(2000) 110-118 ；Buccheri，G.，等人，Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。大部分此类复发在术后前2至3年内发生。因为如果检测得太 迟，复发性/转移性疾病常常是致命的，因此相当多的研究集中在处于早期，从而潜在地可 治疗的分期的癌症复发上。因此，许多癌症患者例如LC患者经历了频繁包括使用CEA的定期监测的术后监 测方案。已显示手术切除术后一年使用CEA的系列监测甚至在疑似症状或体征不存在的 情况下，在大约97%的特异性下以大约29%的灵敏度检测到早期术后复发/转移性疾病 (Buccheri，G.，等人，Ann. Thorac. Surg. 75(2003)973-980)。因此，术后患有 LC 的患者的随 访是合适的生物化学标记物的用途的最重要的领域之一。由于s印rase在被调查的LC患 者中的高度灵敏度，seprase (单独地或与一个或更多个其他标记物组合)可能极大地帮助 LC患者的随访，尤其在术后LC患者的随访。包括s印rase和一个或更多个LC的标记物的 标记物组合在LC患者的随访中的用途代表了本发明的另外的优选实施方案。本发明在优选实施方案中涉及s印rase在癌症的诊断领域中的用途。优选， seprase分别用于肺癌(LC)、结肠癌(CRC)、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子 宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌的评估。在另外的优选实施方案中，本发明涉及seprase作为与一个或更多个另外的癌症 标记分子组合的癌症例如一般性癌症或特定类型的癌症(例如肺癌、结肠癌、食道癌、头颈 癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺 癌)的标记分子的用途。另外的标记分子可以是癌症类型非特异性一般性标记分子和/或 癌症类型特异性标记分子，例如肺癌或结肠癌的标记物。Seprase和至少一个另外的标记物 用于获自个体的液体样品中癌症例如肺癌或结肠癌的评估。优选选择的可将其与seprase 的测量组合的其他癌症标记物是 Cyfra 21-1、CEA、NSE、CA125、CA19-9, PSA、ASC、S100A12 和NNMT。特别地，优选选择的可将s印rase的测量与其组合的其他LC标记物CYFRA 21-1, CEA和/或NSE。用于评估癌症例如LC的优选标记物组包括seprase和至少一个选自CYFRA 21-1和CEA的其他标记分子。
如本领域技术人员将理解的，存在许多使用两个或更多个标记物的测量以改进调 查中的诊断问题的方法。在相当简单但通常有效的方法中，如果样品对于至少一种被调查 的标记物是阳性的，则假定为阳性结果。这可以例如是当诊断感染性疾病如AIDS时的情 况。然而，频繁地，评估标记物的组合。优选，将测量的标记物组的标记物例如s印rase 和CYFRA 21-1的值算术组合，并且使组合的值与基本诊断问题发生关系。可通过任何合 适的现有技术数学方法来组合标记物值。用于使标记物组合与疾病发生关系的熟知的 数学方法使用方法如判别分析(DA)(即线性-、二次-、正则化-DA)、核方法(即SVM)、 非参数法(即k-最近邻分类器(k-Nearest-Neighbor Classifiers))、PLS(偏最小二 乘法)、基于树的方法(即逻辑斯蒂回归、CART、随机森林法(RandomForest Method)、 Boosting/套袋法(Bagging Methods))、广义线性模型(即逻辑斯蒂回归)、基于组成分 的方法(Principal Components basedMethod)(即SIMCA)、广义加法模型、基于模糊逻辑 的方法(Fuzzy Logicbased Method)、神经网络和基于遗传算法的方法。本领域技术人 员在选择合适的方法评估本发明的标记物组合中将没有问题。优选，用于使本发明的标 记物组合例如与LC的不存在或存在发生关系的方法选自DA(即线性_、二次_、正则化判 别分析)、核方法(即SVM)、非参数法(即k-最近邻分类器)、PLS(偏最小二乘法)、基 于树的方法(Tree-BasedMethod)(即逻辑斯蒂回归、CART、随机森林法、Boosting法)或 广义线性模型(即逻辑斯蒂回归)。关于此类统计方法的详细内容见于下列参考文献 Ruczinski，I·，等人，J· of Computational and Graphical Statistics，12 (2003) 475-511 ； Friedman，J. H.，J. of the American Statistical Association84(1989) 165-175 ； Hastie， Trevor, Tibshirani， Robert， Friedman， Jerome， The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics (2001) ；Breiman，L.，Friedman，J. H.， Olshen，R. A.，Stone，C. J. (1984)Classification and regression trees，California Wadsworth ；Breiman, L，Random Forests，Machine Learning，45 (2001) 5-32 ；Pepe，M. S.， TheStatistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction， Oxford Statistical Science Series 28(2003)；禾口 Duda，R. 0.，Hart，P. E.，Stork，D. G.， Pattern Classification, Wiley Interscience，第 2 片反(2001)。本发明的优选实施方案是使用生物学标记物的基本组合的最优化多变量截止值 来区分状态A与状态B (例如区分患病的与健康的)。在该类型的分析中，标记物不再是独 立的而是形成标记物组。诊断方法的精确性通过其受试者工作特性(ROC)(特别地参见Zweig，Μ. H.，和 Campbell,G.，Clin. Chem. 39(1993)561-577)得到最佳描述。ROC图是由在整个观察到的数 据范围内连续改变决策阈值产生的所有灵敏度/特异性对的曲线。实验室检测的临床性能取决于其诊断精确性或正确地将受试者分类至临床相关 亚组的能力。诊断精确性测量检测的正确区分被调查的受试者的两个不同状况的能力。此 类状况是例如健康和疾病或良性疾病对恶性疾病。在各情况下，ROC曲线通过在完全的决策阈值范围内将灵敏度对1-特异性作图 来描述两个分布之间的重叠。灵敏度或真阳性分数[定义为(真阳性检测结果的数目)/ (真阳性检测结果的数目+假阴性检测结果的数目)]在y轴上。这也称为在疾病或病状存在的情况下的阳性。其只根据受影响的亚组来计算。假阳性分数或ι-特异性[定义为 (假阳性结果的数目)/(真阴性结果的数目+假阳性结果的数目)]在X轴上。其是特异 性的指数并且完全根据未受影响的亚组来计算。因为通过使用来自两个不同亚组的检测结 果完全分别地计算真阳性分数和假阳性分数，因此ROC曲线不依赖于样品中疾病的流行性 (prevalence)。ROC曲线上的各点代表相应于特定决策阈值的灵敏度/1-特异性对。具有 完美区分(两个结果的分布中无重叠)的检测具有通过左上角的ROC曲线，其中真阳性分 数是1.0或100% (完美的灵敏度)，并且假阳性分数为0(完美的特异性)。无区分(对 于两组为相同的结果分布)的检测的理论曲线是从左下角至右上角的45°对角线。大部 分曲线落在这两个极端值之间。(如果ROC曲线完全落在45°对角线以下，这可通过将“阳 性”标准从“大于”转变成“小于”或反之亦然来容易地矫正)。定性地，曲线越接近左上方 的角，检测的总体精确性越高。定量实验室检测的诊断精确性的一个优选方法是利用单个数字表示其性能。这样 的总体参数例如称为“总误差(total error)”或备选地“曲线下的面积=AUC”。最普遍的 全局测量是ROC曲线下的面积。按常规，该面积总是大于0. 5 (如果不是，可颠倒决策规则 来使其大于0. 5)。值在1. 0 (两组的检测值完全分离)至0. 5 (两组检测值之间无显著分布 差异)之间变化。面积不仅取决于曲线的特定部分例如离对角线最近的点或在90%特异性 下的灵敏度，而且还取决于整个曲线。这是ROC曲线接近完美曲线(面积=1.0)的程度的 定量描述性表述。在优选实施方案中，本发明涉及用于通过分别测量样品中至少s印rase和CYFRA 21-1以及任选地CEA和/或NSE的浓度，然后使测定的浓度与癌症例如LC或CRC的存在 或不存在发生关系来提高癌症例如LC或CRC对健康对照的诊断精确性的方法，当与基于任 何单个的单独调查的标记物的分类相比较时，改进导致更多的患者被正确地分类为患有癌 症，例如LC或CRC对健康对照。在根据本发明的优选方法中，分别测定至少生物标记物s印rase和CYFRA 21-1的 浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC或CRC。在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物s印rase和CEA的 浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC或CRC。在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物s印rase、CYFRA 21-1和CEA的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC或CRC。在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物s印rase、CYFRA 21-1和CEA的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC或CRC。在根据本发明的另外的优选方法中，分别测定至少生物标记物s印rase、CYFRA 21-1和NSE的浓度，并且将标记物组合用于评估癌症例如LC或CRC。提供下列实施例、参考文献、序列表和图来帮助理解本发明，其真实范围示于所附 权利要中。应当理解，可在所示的方法中进行变动而不背离本发明的精神。附图概述

图1显示结直肠癌(CRC)患者和健康对照患者以及健康对照中血清s印rase浓度 的分布。图2显示肺癌(LC)患者和健康对照中血清s印rase浓度的分布。
图3显示人s印rase的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。实施例1使用大鼠单克隆抗s印rase抗体(克隆D8、D28和D43)作为s印rase特异性结合 分子(Pineiro-Sanchez，Μ. -L.，等人，J. Biol. Chem.，272 (1997) 7595-7601)。单克隆大鼠IgG的生物素化使单克隆大鼠IgG(克隆 D28 或 D43)在 IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl 中达到10mg/ml。每mllgG溶液加入50 μ 1生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3. 6mg/ml于DMSO 中)。在室温下进行 30 分钟后，将样品在 Superdex 200 (IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl)上进行层析。收集含有生物素化的IgG的级分。单克隆大鼠IgG的地高辛化(Digoxygenylation)使单克隆大鼠IgG (克隆 D8 或 D43)在 IOmM NaH2P04/Na0H, 30mM NaCl，pH 7. 5 中 达到10mg/ml。每mllgG溶液加入50 μ 1地高辛-3-0-甲基羰基-ε -氨基己酸-N-羟基 丁二酷亚胺活化月旨(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, Cat. No. 1 333 054) (3. 8mg/ ml 于 DMSO 中)。在室温下进行 30 分钟，将样品在Superdex 200 (IOmM NaH2P04/Na0H, pH 7. 5,30mM NaCl)上进行层析。收集含有地高辛化的IgG的级分。实施例2用于人血清和血浆样品中s印rase的测量的ELISA。为了检测人血清或血浆中的s印rase，发展了夹心ELISA。在第一测定形式中，将 缀合有生物素的抗seprase单克隆抗体和缀合有地高辛(参见实施例1)的等分用于捕 获和检测抗原(D28XD8形式)。在第二测定形式中，将分别缀合有生物素和地高辛的抗 seprase单克隆抗体D43(参见实施例1)的等分用于捕获或检测抗原(D43XD43形式)。将样品(75 μ 1)与150 μ 1各自含有0. 375 μ g的D28_生物素和D8-地高辛抗体 或备选地D43-生物素和D43-地高辛抗体的抗体试剂于温育缓冲液(40mM磷酸盐、200mM酒 石酸钠、IOmM EDTA、0. 05%苯酚、0. 聚乙二醇 40000、0· Tween 20,0. 2% BSA,0. 1% 牛IgG和0. 02% 5-溴-5-硝基-1，3- 二噁烷并且调整至pH 7. 4)中混合。在温育2小时后，将2X100 μ 1的混合物转移入链霉抗生物素涂铺的微量滴定板 的分开的孔中，再温育另外1小时。用清洗缓冲液(10mMTris、150mM NaCl,0. 05% Tween 20)清洗板3次。在下一步骤中，用30mU/ml的通用缀合缓冲液(Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim, Germany, Catalog #11684825) Φ W^liftι Φ "HRP fAtx^ (Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany, Catalog#1633716)温育孔，进行60分钟，然后如之前一样进行清洗。^Bffl 100μ 1(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog#12034425)温育孔进行1小时。加入2N硫酸(50 μ 1)终止显色并且将蓝色转变成黄色。用ELISA读数器在450nm测量0D。所有温育在室温下进行。用温育缓冲液预稀释人血清或血浆的样品至 0.15%的终浓度。为了进行校准，将血清池用作标准。用温育缓冲液将其稀释至 0. 09/0. 18/0. 27/0. 36/0. 45% 的终浓度以分别产生具有 0. 03/0. 06/0. 09/0. 12/0. 15 单位
17/ml的任意给定的值的标准。通过线性回归分析计算校正曲线方程，将其用于将孔的吸光度读数转换成相应的 浓度值。将结果乘以预稀释因子以获得各样品本身的浓度。实施例3CRC研究群体在第一研究中，使用来源于49孔表征的患有结直肠癌(表1中给出的UICC分类) 的患者的样品。魁CRC研究跨UICC分期的样品的分布 与获自50个明显健康的无任何已知恶性疾病(=对照组群)的个体的对照样品 相比较，评估表1的样品。实施例4LC研究群体完全不依赖于第一研究的第二研究集中于非小细胞肺癌(NSCLC)。更具体地，调查 患有主要类型的NSCL、腺癌和鳞状细胞癌的患者。表2a描述了癌症组群的类型和分期分 布。表 2aLC研究LC样品的类型和分期 本研究中的对照组群经特别地定义包括来自表2b中描述的吸烟者和不抽烟者 的样品。对各个体进行肺量测定法(spirometry)肺功能检测(Miller，Μ. R.等人，Eur. Respir. J. 26 (2005) 319338)。只有供体的结果在正常范围内时，才将样品包括在对照组群中。表 2bLC研究对照组群的组成 实施例5S印rase区分癌症患者与健康对照seprase的血清浓度在癌症患者与健康对照之间显著不同，如在两个研究中发现 的一样。在图1和2中，显示了使用D28和D8抗体的组合物测定的结果。癌症患者组群的平均浓度显著比对照组群的低在CRC和LC研究中分别看到患者 中的22. 6和20. 9U/ml对对照中的33. 6和35. 6U/ml。对于对各对照组群产生95%的特异 性的截止值，结直肠癌的灵敏度为67%。对于肺癌其为62%。灵敏度对于癌症的所有分期都相似，如从CRC和LC数据(表3和4)可看到的。因 此，seprase可用作疾病的早期指示剂。对于肺癌，对于鳞状细胞癌的灵敏度比对于腺癌的 更高(表4)。^t 3CRC研究灵敏度取决于UICC分类
LC研究灵敏度取决于类型和分期 使用只检测seprase的二聚体或多聚体形式的2个D43抗体的测定的结果与其密 切相关(数据未显示)。实施例6用于CRC和LC的其他标记物的灵敏度除了 seprase以外，我们在CRC和LC研究样品中测定了 10个其他熟知的肿瘤标 记物。在该情况下使用可商购获得的检测试剂盒。为了在它们之间进行公平比较，将被调 查的各标记物的截止值设置为在各自研究的对照组群中产生95%的特异性。表5提供了各标记物对于两种癌症类型的检测的灵敏度。魁CRC和LC的不同癌症标记物灵敏度 S印rase对于CRC和LC显示相似的灵敏度。总体上，其平均为64. 5%，为在所有 评估的标记物中观察到的最高值。只有Cyfra 21_1具有相同的平均灵敏度。然而，Cyfra 在CRC的检测中不如s印rase有效。与这两者相比较，通过所有其他测量的肿瘤标记物显 示的性能相当差。实施例7标记物组合如果各组的至少一个标记物超过某个阈值，则个体被分类为患有癌症。通常，此类 截止值与用于单个标记物情况的值不同，但类似地对于各组合物产生95 %的特异性。两个最显著的标记物s印rase和Cyfra 21-1的组合显著地提高了癌症的检测并 且在LC研究中产生80%的灵敏度。实施例8使用Seprase作为肿瘤标记物进行的不同癌症与年龄匹配的健康对照的区分在该研究中，测量来自患有不同癌症疾病的良好表征的患者的样品(样品编号和 UICC分类提供于表6中)。通过将表6的样品与264个年龄匹配的对照患者相比较来进行 评估，所述对照患者是无任何已知恶性疾病的明显健康的个体。在该对照组群中，测定截止 值，获得95%的特异性。 不同癌症实体中的灵敏度
在食道癌、头颈癌、胃癌和胆管癌中以及对于LC和CRC (表5中显示的数据)获得 了对于s印rase的高灵敏度。已发现s印rase对于胰腺癌和肾癌的良好灵敏度。还发现 seprase在子宫颈癌、卵巢癌和乳腺癌的评估中的较低的灵敏度。尽管在筛查设置(在95% 的特异性下)中在乳腺癌中具有相对较低的灵敏度(18%)，但s印rase还可被认为是乳腺 癌的复发监测的有吸引力的标记物。常规用于该期望的用途的标记物CA 15-3和CEA在乳 腺癌集合中分别只显示6%和11%的灵敏度，这低于标记物s印rase。
权利要求
用于体外评估癌症的方法，其包括测量样品中下列物质的浓度和/或活性a)seprase多肽或其片段，b)任选地一个或更多个其他癌症标记物，和c)在癌症的评估中使用步骤(a)和任选地步骤(b)的测量结果，其中减少的seprase多肽和/或其片段的浓度和/或活性预示着癌症。
2.权利要求1的方法，其用于评估特定癌症类型。
3.权利要求2的方法，其中特定癌症类型是肺癌、结肠癌、食道癌、头颈癌、胃癌、胆管 癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌。
4.权利要求2或3的任一项的方法，其中特定癌症类型是肺癌、结肠癌、食道癌、头颈 癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌或乳腺癌。
5.权利要求2至4的任一项的方法，其中特定癌症类型是肺癌、结肠癌、食道癌、头颈 癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌或肾癌。
6.权利要求2至5的任一项的方法，其中特定癌症类型是肺癌、结肠癌、食道癌、头颈 癌、胃癌或胆管癌。
7.权利要求2至6的任一项的方法，其中癌症是肺癌(LC)或结直肠癌(CRC)。
8.权利要求2至7的任一项的方法，其中癌症是肺癌(LC)。
9.权利要求1的方法，其中所述一个或更多个步骤(b)的其他标记物是癌症类型非特 异性一般性癌症标记物。
10.权利要求1的方法，其中所述一个或更多个步骤(b)的其他标记物是癌症类型特异 性癌症标记物。
11.权利要求1的方法，其中所述一个或更多个步骤(b)的其他标记物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。
12.权利要求11的方法，其中所述一个或更多个其他标记物是CYFRA21-1。
13.权利要求11的方法，其中所述一个或更多个其他标记物是CEA。
14.权利要求1至13的任一项的方法，其中样品是体液样品。
15.权利要求1至14的任一项的方法，其中样品是血液、血清或血浆样品。
16.权利要求1至15的任一项的方法，其中样品是人样品。
17.权利要求1至16的任一项的方法，其中测量s印rase多肽和/或其片段的浓度。
18.权利要求17的方法，其中通过免疫学方法测量浓度。
19.权利要求1至18的任一项的方法，其中测量seprase多肽的二聚体或多聚体形式。
20.权利要求1至19的任一项的方法，其中测量seprase多肽的单体形式。
21.权利要求1至21的任一项的方法，其中测量s印rase多肽和/或其片段的酶促活性。
22.权利要求21的方法，其中测量抗血纤溶酶切割活性。
23.seprase多肽和/或其片段在癌症的评估中的用途，其中减少的s印rase和/或其 片段的浓度和/或活性预示着癌症。
24.抗s印rase抗体和/或其片段在癌症的评估中的用途，其中减少的s印rase和/或 其片段的浓度和/或活性预示着癌症。
25.用于测量seprase多肽和/或其片段的酶促活性的试剂在癌症的评估中的用途，其中减少的seprase和/或其片段的浓度和/或活性预示着癌症。
26.权利要求23至25的任一项在肺癌特别地NSCLC的评估中或在结肠癌特别地结直 肠癌(CRC)的评估中的用途。
27.包括s印rase多肽和/或其片段以及一个或更多个其他癌症标记物的标记物组在 癌症的评估中的用途，其中减少的seprase多肽和/或其片段的浓度和/或活性预示着癌 症。
28.权利要求27的用途，其中一个或更多个标记物是癌症类型非特异性和/或癌症类 型特异性标记物。
29.权利要求28的用途，其中一个或更多个其他标记物在肺癌或结肠癌的评估中是肺 癌标记物。
30.权利要求27至29的任一项的用途，其中一个或更多个其他标记物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、CA19-9, CA125、PSA、ASC、S100A12 和 NNMT。
31.权利要求27至30的任一项的用途，其中标记物组包括至少s印rase和/或其片段 和 CYFRA 21-1。
32.用于进行根据权利要求1至22的任一项的方法的试剂盒，所述试剂盒包括特异性 地测量seprase多肽和/或其片段以及一个或更多个其他癌症标记物所需的试剂。
全文摘要
本发明涉及有助于评估癌症的方法。其公开了人成纤维细胞活化蛋白(FAP/seprase)作为不同癌症类型的通用标记物的用途。Seprase有助于与肺有关的癌症或肺癌(LC)或结肠癌例如非小细胞肺癌(NSCLC)或结直肠癌(CRC)，而且还可能其他特定类型的癌症的评估。此类特定癌症类型是例如食道癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌和前列腺癌。此外，其特别地涉及用于通过测量来源于个体的液体样品中的seprase来从所述样品评估癌症的方法。seprase的测量可以例如用于癌症的早期检测或用于经历手术的患者的监测。
文档编号G01N33/574GK101896818SQ200880119930
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月8日 优先权日2007年12月10日
发明者J·P·科钱, J·卡尔, M·塔克, M·罗斯勒, W·罗林格 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司