作为生物标记物用于上皮来源的癌症的诊断和预后的cyr61的制作方法

专利名称：作为生物标记物用于上皮来源的癌症的诊断和预后的cyr61的制作方法
作为生物标记物用于上皮来源的癌症的诊断和预后的CYR61相关申请的交叉引用
本申请要求2005年2月18日提交的美国临时专利申请NO. 60/654,111在35 U.S.C.§ 119 (e)之下的权益发明领域
本发明涉及通过评定从患者获得的尿液样品中Cyr61的水平 用于上皮来源的癌症的诊断和预后的方法。发明背景
癌症存活率中最重要的因素之一是在早期的检测。检测癌症早 期事件的临床分析提供了介入和防止癌症发展的机会。随着基因描绘 (profiling)和蛋白质组的发展，在可用于诊断和预测特定癌症的分子 标记物或"生物标记物"的鉴定方面有了显著的进展。例如，对于前列 腺癌来说，抗原PSA (前列腺特异性抗原)可以在血液中检测，是存在 前列腺癌的指示。因而，存在前列腺癌风险的男性的血液可以快速、容 易和安全地筛选提高的PSA水平。
虽然在癌症检测领域存在着显箸的进展，本领域仍然需要鉴定 可以容易地用于临床应用的用于各种癌症的新的生物标记物。例如，迄 今为止，对于使用易于检测的生物标记物诊断乳腺癌，存在着相对较少 的可用选择。EGFR的过量表达，特别是伴随着雌激素受体的减量调节， 是乳腺癌患者中不良预后的标志.此外，在乳腺癌肺瘤组织样品中Cyr61 的增量调节已经在美国专利申请No. 20040086504中注意到，然而， Cyr61的检测涉及侵入性的步骤，没有搅动使用尿液用于Cyr61的分析。 乳腺癌的其他标记物包括血液中高水平的M2丙酮酸激酶(M2 PK)(美 国专利NO. 6,358,683 )、血液中高的ZNF217蛋白水平(WO 98/02539 ) 以及对于诊断有用的、乳腺癌中新近鉴定的蛋白质PDEBC的差异表达 (美国专利申请No. 20030124543 )。这些生物标记物提供了诊断的可 选择方法，然而，它们没有被广泛地使用，许多涉及了侵入性的检测步 骤。此外，尽管使用许多组织化学遗传学的和免疫学的标记物，临床医
师仍然难以预测哪些肿瘤将转移到其他器官。
生物标记物的鉴定对于改善诊断、预后以及疾病的治疗是特别相关的。因而，本领域需要鉴定可以快速、容易和安全地检测的选择性 的生物标记物。这样的生物标记物可以用于诊断、分期、或监视患有癌 症的个体的进展或治疗。生物标记物也可以用于区分受限的器官和转移 性的癌症。
涉及紳瘤的"血管生成转换"的生物标记物是特别有用的，因 为肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的。当肿瘤变为血管生成性时，肿 瘤逐渐地扩展，并可以散布转移性的细胞(HanahanD, FolkmanJ., Cell 86:353-364,1996; Smith-Mcune and Weidner N., Cancer Research, 54: 800-804)。因此，涉及肺瘤向血管生成性状态的转换的生物标记物的鉴定 将允许人们诊断受限的器官和转移性的癌症。发明概述
本发明基于这种发现，Cyr61蛋白存在于患有卵巢癌和乳腺癌 的患者的尿液中，并且，在含有这些癌症的恶性形式的患者中Cyr61蛋 白的水平更高。因而，本发明涉及预后评估的方法，以及涉及便于上皮 来源的癌症的诊断的方法，所述上皮来源的癌症例如乳腺癌、结肠癌、 前列腺癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肺癌和皮肤癌， 以及其它的癌症。Cyr61作为治疗效力的标记物也已/>开。
特别地，尿液中Cyr61蛋白的监视水平可以用作初步筛选来便 于卯巢或乳腺癌的诊断；与年龄和性别匹配的健康对照样品相比，在来 自测试患者的样品的尿液中检测的更高数量的Cyr61蛋白是患者患有癌 症的指示。换句话说，存在着患者患有癌症的提高的可能性。然后可以 进行进一步的测试来确认诊断结论，例如乳房造影法(乳腺癌)、超声、 PET扫描、MRI或任何其他成像技术、活组织检查、临床检查或 ductogram。此外，监^L在患者中随着时间的Cyr61蛋白水平，发现随着 时间的表达提高，可以用于指示癌症已经提高了它的侵略性，并因而患 者具有不良的预后。因而临床医师可以调节治疗。因此，测量尿液中 Cyr61的水平提供了快速、容易和安全的筛选，其可用于患者中上皮来 源的癌症，例如乳腺或卵巢癌的诊断和预后。
不受理论的限制，相信的是，Cyr61涉及血管生成转换。因此，
Cyr61的检测被认为指示了癌症已经转换成更为血管生成性的疾病，并 因而需要更为侵略性的治疗。为支持这一点，已经发现Cyr61增量调节 涉及上皮间质转换(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT )的分子(参 见实施例3) 。 EMT是重要的过程，通过该过程上皮细胞获得间质性、 成纤维细胞样的性质，并显示降低的细胞间粘附和提高的运动性。相信 的是，EMT样事件在胂瘤发展和恶性转化期间出现，为癌细胞赋予侵入 和净争移'〖生的'1"生质(Lionel Larue 1 and Alfonso Bellacosa Oncogene (2005 ) 24,7443-7454)。
在一个实施方式中，提供了一种方法，用于便于个体中上皮 来源的癌症的诊断。所述方法包括测量获自个体的测试尿液样品中存在 的Cyr61水平，并比较观察到的Cyr61水平与对照尿液样品中存在的 Cyr61水平。与对照样品相比在测试样品中更高的Cyr61水平，是提高 的癌症可能性的指示。优选的，所述水平是所述对照物的1.5倍、更优 选的2倍或更多。
优选的，本发明的方法用于上皮来源的癌症、特别是乳腺癌 和卯巢癌的早期检测。例如，可以在年度体检期间由医师来筛选个体。 阳性的测试结果，其中Cyr61的水平高于对照物的水平，将使进一步的 诊断评估有正当理由。
术语"对照样品，，是指从相信不患有癌症的"正常的，，或"健 康的，，个体获得的尿液样品。对照物可以使用本领域^^知的方法来选 择。 一旦很好地确定了对照群体的水平，来自测试尿液样品的阵列结果 可以直接与已知的水平比较。
术语"测试样品"是指从要检测上皮来源的癌症的患者获得 的尿液样 品。
在一个方面，要诊断的上皮来源的癌症是乳腺癌、基底细胞 癌、腺癌、胃肠道癌症，例如唇癌、口腔癌、食道癌、小肠癌症和胃癌、 结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肺癌和皮肤癌， 例如扁平细力包和基底细胞癌症、前列腺癌、肾脏细胞癌，和其他影响整 个身体的上皮细胞的已知的癌症。优选的，所述癌症是乳腺癌或卵巢 癌。
本发明还预期评定获自同 一 个体的多个测试样品中存在的 Cyr61水平，其中随着时间Cyr61数量的逐渐提高指示癌症肿瘤的提高
的侵略性(例如，转移可能性)。因而，Cyr61的水平充当了疾病状态 和阶段的预测物。可以相隔数天、数周或数月采集样品。
本发明进一步预期评定Cyr61水平来监视被设计以治疗患有上皮来源的癌症的患者的治疗方案的治疗效力。
在本发明的一个方面中，通过用特异性结合Cyr61蛋白或其部分的基于抗体的结合部分接触测试样品或其制备物来测试尿液样品 中存在的Cyr61水平。基于抗体的结合部分与Cyr61形成可以被检测的 复合物，从而容许测量Cyr61的水平。
基于抗体的免疫分析是测量Cyr61蛋白水平的优选的方式。 然而，可以使用本领域技术人员已知的任何方法来评定Cyr61水平。例 如，在某些实施方式中，通过质谱法，包括SELDI质谦法来分析Cyr61 表达水平。
在进一步的实施方式中，本发明提供了试剂盒，其包含用于 测量尿液样品中的Cyr61的手段。
在另一个实施方式中，提供了指导个体的治疗的方法。所述 方法包括让个体测试获自所述个体的尿液样品中的Cyr61水平，其中临 床医师审查该结果，如果尿液具有比对照样品中的Cyr61水平更高水平 的Cyr61，所述临床医师指导所述个体治疗上皮来源的癌症。所述测试 可以在所述个体居留的同一国家、或在其他国家进行，所述结果例如通 过网站变为可用的，或被传送给临床医师。
下文中公开了本发明的其他方面。附图
的简要说明
附随的图画，合并到本说明书中并作为本说明书的 一部分， 与说明书一同说明了本发明的实施方式，用来解释本发明的目的、益处 和原理。
附图la和lb显示了在卵巢癌患者的尿液中检测的Cyr61。附 图la:免疫印迹检测卵巢癌患者的尿液中的Cyr61免疫反应性蛋白 (OV3， 0VCAR3细胞提取物；Control,对照样品；Benign,来自良性 癌症患者的尿液；Malignant,来自恶性癌症患者的尿液。附图lb:免疫 印迹检测卵巢癌患者尿液中Cyr61免疫反应性蛋白的数量柱形图。每个 阶段11=12。附图2显示了 Cyr61的氨基酸序列(SEQ ID NO: 1)。
附图3显示了乳腺癌患者的尿液中Cyr61的Western印迹。 来自卵巢癌细胞系OVCAR-5 (OV5)的细胞溶胞产物用作阳性对照， 泳道l。在来自年龄、性别匹配的健康对照(CTL)(泳道2)、导管原 位癌(DCIS )(泳道3 )、非典型的导管hyperplasia (ADH)(泳道4 )、 侵入性(Invasive)(泳道6 )和转移性(Met)乳腺肿瘤患者(泳道7 ) 的尿液中分别没有检测到CYR61免疫反应性蛋白。发明的详细说明 -
我们发现，患者的尿液样品中存在的Cyr61水平与上皮来源 的癌症的存在或不存在相关。
如在此使用的，"上皮来源的癌症"是指由上皮细胞产生的 癌症，其包括但不限于，乳腺癌、基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、 口腔癌、食道癌、小肠癌和胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵 巢癌、子宫颈癌、肺癌、乳腺癌和皮肤癌，例如扁平细胞和基底细胞癌、 前列腺癌、肾脏细胞癌、和其他影响整个身体的上皮细胞的已知癌症。
术语"侵略性的"或"侵入的"对于癌症是指肿瘤扩展超过 它的边界进入邻近组织的倾向(Darnell, J.( 1990), Molecular Cell Biology, Third Ed, W. H. Freeman， NY)。侵入性癌症可以与器官限制的癌症形 成对照，其中肿瘤被限制在特定的器官。肿瘤的侵入性质常常伴有蛋白 水解酶的作用，例如胶原酶，其降解基质和基底膜材料来允许肿瘤扩展 超出被嚢的限制，并超出胂瘤位于其中的特定组织的限制。
如在此使用的术语"转移"是指癌症从起源器官向患者中其 他远端位点的散布的情况。肿瘤转移的过程是多级的事件，涉及局部侵 入和细胞间基质的破坏、进入血管的入血管内渗、淋巴的或其他通道的 转运、在循环中的存活、在第二位点中的血管的出血管渗出，以及在新 位置的生长(Fidler,等人,Adv. Cancer Res. 28,149-250 ( 1978) ， Liotta, 等人，Cancer Treatment Res. 40,223-238 ( 1988 ) , Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948,175-224( 1988 )以及Zetter, N. Eng. J. Med. 322, 605-612 (1990))。提高的恶性细胞运动性已经与动物以及人类肿瘤中增强的 转移可能性相关联(Hosaka,等人，Gann 69,273-276 ( 1978 )以及 Haemmerlin,等人,Int. J. Cancer 27, 603-610 ( 1981 ))。在优选的实施方式中，所述尿液样品被处理以防止Cyr61蛋 白的降解。抑制或防止降解的方法包括但不限于，用蛋白酶处理样品、 冷冻样品或将样品置于水上。优选的，在分析之前，将样品持续地保持 在条件下以防止Cyr61蛋白的降解。
如在此使用的，"原发肿瘤，，是在患者体内的第一位点出现 的肿瘤，可以不同于"转移性肿瘤"，其在远离原发胂瘤的远端位点出 现在个体的身体中。
如在此使用的，"LCIS"是指小叶原位癌。LCIS也称为小叶 瘤形成，有时被分类为非扩散乳腺癌的种类。它不渗透穿过小叶的壁。 虽然它本身通常不变为侵入性的癌症，有这种状况的女性具有在同一个 或对侧乳腺中发展侵入性乳腺癌的更高的风险。
如在此使用的，"DOS"是指导管原位癌。导管原位癌是最 常见的非扩散乳腺癌种类。在DCIS中，恶性细胞已经转移通过导管的 壁进入乳腺的脂肪组织。粉刺状癌是一种DCIS,其比其他种类的DCIS 更可能在乳房肺瘤切除术后回到相同的区域，并且与其他形式的DCIS 相比更紧密地关联着侵入性导管癌的最终发展。
如在此使用的，"Cyr61"是指Genebank登记号Genp印t, 000622和AAB58319 ( Homosapiens) ( SEQ ID NO: 1 )(附图2 )的 Cyr61蛋白。Cyr61是富含半胱氨酸的肝素结合蛋白，其由细胞表面和 细胞外基质分泌并与之相关联。术语"Cyr61"还涵盖物种变体、同源 物、等位形式、突变形式和其等同物。
本发明涉及便于在患者中诊断上皮来源的癌症的方法。在一 个实施方式中，所述方法包括测量获自怀疑患有癌症的个体的测试样品 中Cyr61的水平，并比较观察到的水平与对照样品中发现的Cyr61水 平，所述对照样品例如从相信不患有癌症的单个患者或个体群体获得的 样品。Cyr61的水平高于正常的对照中观察到的水平指示癌症的存在。 Cyr61的水平可以通过任何单位来表示，例如，从密度计、光度计或Elisa 平板读数器获得的单位。
如在此使用的，"与对照样品中的水平相比在测试样品中更 高的Cyr61水平"是指Cyr61的数量，其高于对照样品中存在的Cyr61 数量。术语"更高水平"是指一种水平，其统计学上显著地或显著地高 于对照样品中发现的水平。优选的，"更高水平"是至少2倍或更高。
术语"统计学上显著的，，或"显著地"是指统计显著性，一 般意味着两倍标准误差(2SD)在正常的标记物浓度之上，或更高。
为了比较的目的，测试样品和对照样品是相同的类型，也就 是，获自尿液。然而，对照样品也可以是含有与获自健康个体的尿液样 品中通常发现的相同浓度Cyr61的标准样品。
在本发明的一个方面，可以进行第二诊断步骤。例如，如果 发现Cyr61水平指示癌症存在，则可以进行检测所述癌症的其他方法来 确认癌症的存在。可以使用各种其他的诊断步骤的任一种，例如乳房造 影法(乳腺癌)、超声、PET扫描、MRI或任何其他成像技术、活组织 冲企查、临床4全查、ductogram或任l可其他方法。
此外，可以通过跟踪单个患者中的Cyr61水平来评定疾病进 展。例如，患者状况的改变可以通过比较随着时间在患者中Cyr61表达 水平方面的改变。Cyr61水平的逐渐提高是肿瘤侵入和转移的提高的可 能性的指示。
本发明的预后方法对于确定患有癌症的患者/个体的适当治 疗过程也是有用的。治疗过程是指在诊断之后或在治疗癌症之后对患者 采取的治疗办法。例如，确定癌症复发、散布或患者存活的可能性，可 以帮助确定是否应当采取更保守的或更激进的方法来治疗，或者是否应 当组合治疗形式。例如，当癌症复发是可能的时，有益的是在外科治疗 之前或之后进行化学疗法、放射、免疫治疗、生物学修饰治疗、基因治 疗、疫苗等等，或在患者被治疗期间调整时间跨度。源量cy6/水^
Cyr61水平可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测 量。在本发明中， 一般优选的是使用抗体、或抗体等同物来检测Cyr61 水平。然而，也可以使用用于检测的其他方法。例如，Cyr61水平可以 通过质谱分析来监视。
在一个实施方式中，Cyr61蛋白的水平通过使尿液样品与基 于抗体的结合部分接触来测量，所述基于抗体的结合部分特异性地结合 Cyr61或Cyr61的片段。然后检测抗体-Cyr61复合物的形成作为Cyr61 水平的度量。
术语"基于抗体的结合部分"或"抗体"包括免疫球蛋白分 子和免疫球蛋白分子的免疫活性决定簇，例如，含有特异性结合(免疫
反应)Cyr61、或本发明的其他生物标记物的抗原结合位点的分子。术 语"基于抗体的结合部分"意图包括完整的抗体，例如，任何同种型的 抗体(IgG、 IgA、 IgM、 IgE,等等)，并包括也特异性地与Cyr61蛋白 反应的其片段。抗体可以使用常规技术来片断化。因而，该术语包括抗 体分子的蛋白水解裂解的或重组制备的部分的片段，其能够与某些蛋白 选择性地反应。这种蛋白水解的和/或重组片段的非限制性实例包括 Fab、 F(ab')2、 Fab'、 Fv、 dAbs以及含有由肽接头连接的VL和VH结 构域的单链抗体(scFv) 。 scFVs可以共价地或非共价地连接来形成具 有两个或多个结合位点的抗体。因而，"基于抗体的结合部分"包括抗 体和重组抗体的多克隆的、单克隆的或其他纯化的制品。术语"基于抗 体的结合部分"进一步意图包括人源化的抗体、双特异性抗体和具有来 自抗体分子的至少一个抗原结合决定簇的嵌合分子。在优选的实施方式中，可检测地标记基于抗体的结合部分。
如在此使用的，"标记的抗体"包括通过可检测的方式标记 的抗体，包括但不限于，酶学地、放射性地、荧光地和化学发光地标记 的抗体。抗体也可以用可检测的标签，例如c-Myc、 HA、 VSV-G、 HSV、 FLAG、 V5或HIS来标记。
在使用基于抗体的结合部分用于检测Cyr61的本发明的诊断 和预后方法中，尿液样品中存在的Cyr61蛋白水平与从可检测标记的抗 体发出的信号的强度相关。
在一个优选的实施方式中，基于抗体的结合部分通过将抗体 与酶连接来可检测地标记。随后，当暴露于其底物时，所述酶将与所迷 底物反应，这样来产生化学部分，其可以通过例如分光光度法、荧光或 通过可见装置来检测。可用于可检测标记本发明的抗体的酶包括但不限 于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌的核酸酶、A-V-类固醇异构酶、酵母乙醇 脱氬酶、oc-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化酶、碱性磷 酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿酶、 过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氬酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。化 学发光是可用于检测基于抗体的结合部分的另 一种方法。
检测也可以使用各种其他的免疫分析的任一种来实现。例 如，通过方文射性地标记抗体，有可能通过使用放射免疫分析来4全测抗 体。放射性同位素可以通过例如使用y计数器或闪烁计数器或通过放射
照相的手段来检测。对于本发明的目的特别有用的同位素是3H、 mI、 35S、 "C和优选的125I。
还可能的是用荧光化合物标记抗体。当荧光标记的抗体暴露 于适当波长的光线时，然后由于荧光可以检测它的存在。在最常用的荧 光标记化合物之中有CYE染料、异硫氰酸荧光素、罗丹明、 phycoerytherin、藻青蛋白、另,J藻蓝蛋白、o-phthaldehyde和荧光胺。
抗体也可以使用荧光发射金属，例如铕或其他镧系元素来可 检测地标记。这些金属可以使用金属螯合基团如二亚乙基三胺五乙酸 (DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)来附着于抗体。
抗体也可以通过将它连结到化学发光化合物来可检测地标 记。然后通过检测在化学反应过程期间出现的发光的存在，来确定化学 发光物-抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例有鲁米诺、 萤光素、isoluminol、 theromatic acridinium ester 、咪峻、acridinium盐和 草酸酯。
如上所述，通过免疫分析，例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、 放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA) 、 Western印迹或免疫 组织化学，可以检测Cyr61水平，以下详细地说明每一种方法。免疫分 析例如及其快速的ELISA或RIA，是更一般地优选的。也可以采用抗体 阵列或蛋白芯片，参见，例如美国专利申请NO: 20030013208A1; 20020155493A1; 20030017515和美国专利No: 6,329,209; 6,365,418; 通过完全引用将它们合并在此。
"放射免疫分析"是使用抗原的标记的(例如，放射性标记 的)形式用于检测和测量抗原浓度的技术。用于抗原的放射性标记物的 实例包括3H、 14C和125I。通过使生物样品中的抗原与标记的(例如， 放射性地)抗原竟争结合针对所述抗原的抗体，来测量生物样品中抗原 Cyr61的浓度。为了确保标记的抗原和未标记的抗原之间的竟争结合， 标记的抗原以足以饱和所述抗体的结合位点的浓度存在。样品中的抗原 浓度越高，将结合所述抗体的标记的抗原的浓度越低。
在放射免疫分析中，为了确定结合了抗体的标记的抗原的浓 度，必需从游离抗原中分离抗原抗体复合物。从游离抗原分离抗原抗体 复合物的一种方法是通过使用抗同种型抗血清沉淀所述抗原抗体复合
物。从游离抗原分离抗原抗体复合物的另 一种方法是通过使用福尔马林灭活的S. aureus沉淀抗原抗体复合物。从游离抗原分离抗原抗体复合物 的再另一种方法是通过进行"固相放射免疫分析"，其中抗体被连接(例 如，共价地)到Sepharose珠子、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或孩i滴定孔。 通过比较结合了抗体的标记的抗原的浓度和基于具有已知抗原浓度的 样品的标准曲线，可以确定生物样品中抗原的浓度。
"免疫放射分析"(IRMA)是一种免疫分析，其中抗体试剂 被放射性地标记。IRMA需要产生多价的抗原结合物，通过例如与蛋白 质如兔血清白蛋白(RSA)结合的技术。多价的抗原结合物必需具有每 分子至少2个抗原残基，并且所述抗原残基必需有足够的距离间隔以允 许被至少两个针对所述抗原的抗体结合。将未标记的"样品"抗原以及 被放射性标记的针对所述抗原的抗体添加到含有多价抗原结合物包被 的球体的试管中。样品中的抗原与所述多价抗原结合物竟争抗原抗体结 合位点。在适合的孵育期之后，通过洗涤除去未结合的反应物，测定在 固相上的放射性的数量。结合的放射性抗体的数量与样品中抗原的浓度 成反比。
最常见的酶免疫分析是"酶联免疫吸附分析(ELISA)"。 ELISA是使用标记(酶连接)形式的抗体用于检测和测量抗原的浓度的 技术。存在各种形式的ELISA，其是本领域的技术人员^^知的。在 "Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; Campbell等人，"Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964;和Oellerich, M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22:895-904中描述了本领域已知的标准技术。
在"夹心ELISA"中，抗体(例如，抗画Cyr61)与固相(即, 微量滴定板)连接，并暴露于含有抗原(例如，Cyr61)的生物样品。 然后洗涤固相来除去未结合的抗原。然后标记的抗体(例如，酶连接的) 与结合的抗原(如果存在)结合形成抗体-抗原-抗体夹心。可以与抗体 连接的酶的实例包括》咸性磷酸酶、辣根过氧化酶、荧光素酶、尿酶和P -半乳糖苦酶。酶连接的抗体与底物反应来产生可以测量的有色反应产 物。
在"竟争ELISA"中，抗体与含有抗原(即，Cyr61)的样品 孵育。然后抗原-抗体混合物与包被了抗原(即，Cyr61)的固相(例如，
微量滴定板)接触。样品中存在的抗原越多，越少的游离抗体可用于结 合所述固相。然后向所述固相添加标记的(例如，酶连4妻的)二级抗体 来确定结合到固相的初级抗体的数量。
在"免疫组织化学分析"中，通过将所述组织暴露于对要分 析的蛋白是特异性的抗体，测试组织切片的特定蛋白质。然后通过许多 已知方法的任一种来显现抗体，来确定蛋白质的存在和存在的数量。用 于显现抗体的方法的实例有，例如，通过与所述抗体连接的酶(例如， 荧光素酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或P半乳糖苷酶)或化学方法(例 如，DAB/底物显色)。
根据实践者的偏爱和基于本公开，可以使用其他技术来检测 本发明的生物标记物。这种技术之一是Western印迹(Towbin等人，Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 ( 1979)),其中适当处理的样品在SDS-PAGE 凝胶上跑动，之后转移到固相支持物，例如硝酸纤维素膜。然后可检测 标记的特异性结合Cyr61的抗体可以用于评定Cyr61水平，其中来自可 检测标记的信号的强度相应于存在的Cyr61的数量。例如通过密度测定 法可以测定所述水平。#浮法
此外，可以使用质语法，例如MALDI/TOF (飞行时间)、 SELDI/TOF、液相色i普-质谱法(LC-MS )、气相色语-质i普法(GC-MS )、 高效液相层析-质谱法(HPLC-MS)、毛细管电泳-质语法、核磁共振波 谱法或串联的质谱法(例如，MS/MS、 MS/MS/MS、 ESI-MS/MS,等等) 来检测Cyr61。参见，例如，美国专利申请NO: 20030199001、 20030134304、 20030077616，通过引用将它们合并在此。
质谱方法是本领域公知的，已经被用于定量和/或鉴定蛋白质 (参见,例如Li等人，(2000) Tibtech 18:151-160; Rowley等人，(2000 ) Methods 20: 383-397和Kuster and Ma皿(1998 ) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400)。进一步的，已经开发了允许分离的蛋白质的至少部 分起始测序的质谱技术。Chait等人，Science 262:89-92 ( 1993 ); Keough 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 ( 1999);在Bergman, EXS 88:133-44 ( 2000)中综述。
在某些实施方式中，使用气相离子分光光度计。在其他实施 方式中，使用激光-脱附/电离质谱法来分析样品。现代的激光脱附/电离 质谱法("LDI-MS，，)可以按两种主要的变体来操作基质帮助的激光 脱附/电离("MALDI")质谱法和表面增强的激光脱附/电离("SELDP )。 在MALDI中，被分析物与含有基质的溶液混合， 一滴所述液体置于基 底的表面上。然后基质溶液与所述生物分子共结晶。基底被插入到质谱 仪中。将激光能量导向基底表面，在此它脱附并离子化所述生物分子而 不显著地破碎它们。然而，MALDI作为分析工具有局限性。它不提供 分馏样品的手段，基质材料可能影响检测，特别是对于低分子量的被分 析物。参见，例如，美国专利NO. 5,118,937 (Hillenkamp等人，)，和 美国专利NO. 5,045,694 ( Beavis & Chait)。
在SELDI中，基底表面被修饰，使得它是脱附过程中的主动 参与者。在一个变体中，所述表面用选择性结合目标蛋白的吸附试剂和 /或捕获试剂衍生化。在另一种变体中，所述表面用激光轰击时不脱附的 能量吸收分子来衍生化。在另一种变体中，所述表面用分子衍生化，所 述分子结合目标蛋白质，并且含有在应用激光时被打断的光解的键。在 这些方法的每一种中，衍生化试剂一般被定位在施加样品的基底表面上 的特定位置。参见，例如美国专利No. 5,719,060和WO 98/59361。例如， 通过使用SELDI亲和性表面来捕获被分析物并向捕获的被分析物添加 含有基质的液体来提供能量吸收材料，可以组合这两种方法。
关于质语仪的其他信息，参见，例如Principles of Instrumental Analysis, 3rd edition., Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985;和Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4.sup.th ed. Vol. 15 ( John Wiley & Sons, New York 1995 ) , pp. 1071-1094。
检测标记物或其他物质的存在一般将包括信号强度的检测。 随后，这可以反映结合到基底上的多肽的数量和性质。例如，在某些实 施方式中，可以比较第一样品和第二样品的光谱的峰值信号强度(例 如，视觉地，通过计算机分析，等等)，来确定特定生物分子的相对数 量。可以使用软件程序例如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.)来帮助分析质语。质谱4义和它们的技术是本领域的 技术人员公知的。
本领域的任何技术人员理解，质语仪的任何组件(例如，脱 附源、质量分析器、检测，等等)和各种样品制品可以与在此描述的其 他适合的组件或制品，或与本领域已知的那些组合。例如，在某些实施
方式中对照样品可以含有重原子(例如，13c),从而允许测试样品在同一质谱法进行中与已知的对照样品混合。
在一个优选的实施方式中，使用激光脱附时间飞行(TOF) 质谱仪。在激光脱附质谱法中，具有结合的标记物的基底被导入进气系 统中。通过来自电离源的激光将标记物脱附和电离成气相。通过离光学 的组件收集产生的离子，然后在时间飞行质量分析器中，离子被加速通 过短的高压电场并飘入高真空仓室中。在高真空仓室的远端，；故加速的 离子在不同的时间击打在灵敏的检测器表面。由于飞行的时间是离子质 量的函数，在离子形成和离子检测器撞击之间经过的时间可用于鉴定特 定的质量电荷比的分子的存在或不存在。
在某些实施方式中，在第一和第二样品中存在的 一种或多种 生物分子的相对数量通过使用可编程的数字计算机执行算法来部分地 确定。所述算法在第一质谱和第二质谱中鉴定至少一个分值。所述算法 然后比较第一质谱的峰值信号强度和第二质谱的峰值的信号强度。相对 信号强度是存在于第一和第二样品中的生物分子数量的指示。含有已知 数量的生物分子的标准物可以作为第二样品被分析来提供对第 一样品 中存在的生物分子数量的更好的定量。在某些实施方式中，也可以测定 第一和第二样品中生物分子的同一性。
在一个优选的实施方式中，通过MALDI-TOF质谱法来测量 生物标记物水平。 戎#
用于本发明的抗体可以从商业来源获得。做为选择，可以针 对Cyr61、或生物标记物多肽的一部分来产生抗体。如，通过单克隆抗体生产(Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, the Netherlands ( 1984 ); St. Groth 等人，，J. Immunology, ( 1990) 35:1-21; and Kozbor等人，Immunology Today ( 1983 ) 4:72)。通过本领域公知的方法，通过使用蛋白质的抗 原性部分来筛选抗体库，例如噬菌体显示库，也可以容易地获得抗体。 例如，美国专利5,702,892 (U.S.A. Health & Human Services)和WO 01/18058 ( Novopharm Biotech Inc.) />开了用于产生抗体结合结构域片
段的噬菌体展示库和选择方法。 發解试浙盆
本发明还涉及用于上皮来源的癌症的检测和预后评估的商业 性试剂盒。所述试剂盒可以是本领域技术人员已知的任何结构，并且对 于进行在此描述的检测Cyr61的一种或多种方法是有用的。所述试剂盒 是方便的，因为它们提供了如果不是全部也是大多数的基本试剂，用于 进行尿液样品中Cyr61检测的分析。此外，所述分析优选的与标准物或 多个标准物同时进行，所述标准物被包括在试剂盒内，例如，预定数量 的Cyr61蛋白，使得测试的结果可以被定量或校准。
所述试剂盒包括检测Cyr61水平的手段，例如抗体、或抗体 片段，其选择性地结合Cyr61蛋白。所述诊断分析试剂盒优选的配置为 标准的双抗体结合形式，其中一个Cyr61特异性抗体捕获患者样品中的 Cyr61，另一个Cyr61特异性抗体被用于检测捕获的Cyr61。例如，捕获 抗体被固定在固相上，例如分析平板、分析孔、硝化纤维膜、珠子、量 液杆、或洗脱柱的成分。所述第二抗体，即检测抗体， 一般用可检测的 标记来标签，例如量热试剂或放射性同位素。
在一个优选的实施方式中，所述试剂盒包含检测尿液样品中 Cyr61水平的手段。在特定的实施方式中，所述试剂盒包括具有固定在 其上的抗Cyr61抗体的"量液杆"，所述抗体同一性结合Cyr61蛋白。 然后可以使用例如，用量热试剂或放射性同位素可^r测标记的第二抗体 来检测特异性结合的Cyr61蛋白。
在其他实施方式中，分析试剂盒可以采用(但不限于)以下 技术竟争性和非竟争性分析、放射免疫分析(RIA)、生物发光和化 学发光分析、荧光分析、夹心分析、免疫放射分析、斑点印迹、酶连接 分析，包括ELISA、微量滴定板和免疫细胞化学。对于每种试剂盒，分 析的范围、敏感性、精确度、可靠性、特异性和重现性通过本领域技术 人员7>知的方法来确定。
以上描述的分析试剂盒将进一 步提供使用说明和为尿液样本 设计的容器。实施例
通过以下非限制性的实施例进一步说明本发明。
提供这些实施例来帮助理解本发明，不看作是本发明的限制。实施例1: Cyr61作为卵巢和乳腺癌的尿生物标记物的鉴定
我们已经鉴定了 Cyr61蛋白可作为卵巢癌的生物标记物。特 别地，我们显示了来自患有良性和恶性卵巢癌的患者的尿液样品中，与 来自不患有癌症的患者的对照尿液样品相比，存在着Cyr61水平的提高 (附图la和lb)。附图la显示了卵巢癌的免疫印迹检测；Control lanes, 对照样品；Benign lanes,来自含有良性癌症患者的尿液；lanes Malignant lanes,来自含有恶性癌症患者的尿液。附图lb显示了在来自卵巢癌患 者中免疫印迹检测Cyr61免疫反应性蛋白数量的柱形图(每个阶段 n=12)。
我们还进行了来自乳腺癌患者的尿液中Cyr61的Western印 迹(附图3)。在来自患有非扩散性(DCIS)和侵入性乳腺癌、以及非 典型的导管癌(ADH)的患者的尿液样品中，与来自不患有癌症的患者 的对照尿液样品相比，存在着Cyr61水平的提高。实施例2: Cyr61作为血管生成转换的调节物
黄体的形成和死亡分别伴随着显著的血管形成和退化过程。 因而这种内分泌腺作为阐明转动血管生成开和关的分子机制的研究模 型是有用的。在当前的研究中，我们使用了 PGF2oc来诱导第6天和第 IO天黄体的退化。在PGF2a施用后30分钟收集黄体组织。基因微阵列 分析表明抗生成诱导物Cyr61在PGF2ot注射后第6和10天CL中差异 表达。半定量的RT-PCR进一步显示这个基因在早期CL中相比中期和 晚期以显著更高的(p<0.01)水平表达。此外，Cyr61表达在黄体退化 期间降低。免疫组织化学揭示，Cyr61蛋白定位在黄体内皮和类固醇生 成细胞中。为了研究Cyr61的调节，从中周期CL分离黄体类固醇生成 细胞和内皮细胞，并用PGF2cc和TNFa处理。虽然PGF2 cc对于黄体类 固醇生成细胞和内皮细胞中的Cyr61表达没有影响，TNFoc刺激了黄体 内皮细胞中的Cyr61表达，但降低了其在黄体类固醇生成细胞中的转录 水平。总之，Cyr61在早期CL中的高表达表明，这个基因可能与黄体
血管生成相关。在退行CL中Cyr61的降低的水平表明，这个基因的减 量调节可能是黄体退化的检查点。此外，TNFa差异调节黄体内皮细胞 和类固醇生产细胞中的Cyr61表达。因而，该数据表明Cyr61是血管生 成转换的关键调节物，在黄体的生命期期间转动血管生成"开，，和"关"。实施例III: Cyr61作为上皮间质转换(EMT )的调节物
为了评定在侵略性癌症的发展中Cyr61的潜在作用，我们制 备了过量表达Cyr61的稳定的OV5 (卵巢细胞)细胞系(OV5-Cyr61 )。 我们发现，已知涉及上皮间质转换(EMT)和迁移/侵入的许多分子受到 Cyr61调节。使用RT-PCR和过量表达Cyr61的细胞系，我们发现，Cyr61 的增量调节改变了类固醇受体、整联蛋白受体、VEGF和金属蛋白酶的 表达(数据未显示)。例如，当AR表达被减量调节时，类固醇受体ER oc表达被增量调节；MMP-9表达(RT-PCR)和活性(经由酶色谱)被 增量调节，以及MMP-1、 MMP-8、 MMP-3、 MMP-23、 MMP-19表达， 而对MMP-13、 MMP-10和MT1-MMP表达似乎没有影响；MMP-7表达 被减量调节；06、 |33、 oc6和ocV整联蛋白表达被增量调节；VEGF-A和VEGF-C在这些细胞系中增量调节。
使用OV5-细胞系，通过ELISA分析，我们进一步确定了， Cyr61刺激VEGF-A蛋白水平(数据未显示)。使用RT-PCR,我们还 分析EMT相关的转录因子Snail被增量调节，而SIP-1、 Twist和Slug 似乎不受影响。
在Cyr61涉及侵略性癌症发展的进一步的证明中，我们进行 了刮擦迁移和肿瘤侵入分析。采用修改的刮擦迁移分析来评定细胞运动 性。简要地，载体对照和过量表达CYR61的OVCAR-5细胞培养在60mm 陪氏培养皿中。在细胞汇合之后，通过无菌的移液管尖端进行一次刮擦 (无细胞区域)。通过用培养基洗涤三次清除漂浮细胞。用新鲜培养基 孵育细胞5小时。在孵育之前和之后记录刮擦的两个边缘之间的距离。 通过距离除以孕育时间来计算细胞运动速率。这个分析的结果清楚地显 示Cyr61的过量表达提高了运动性。过量表达Cyr61的细胞与不过量表 达Cyr61的细胞相比迁移两倍远。
使用24孔肺瘤侵入系统(DB Bioscience, Bedford, MA )根据 厂家的手册评估过量表达CYR61的细胞的侵入性。OVCAR-5载体对照
和过量表达CYR61的细胞生长到70%汇合，然后胰蛋白酶化并重悬浮 在无血清培养基中。将5x 104个细胞播种到顶部腔室中。完全培养基 (750 yL)用作化学吸引剂，添加到下腔室中。在37。C、 5%(:02的孵 化器中孵育24小时之后，从上腔室除去培养基。将插入板转移到含有 0.5ml/孔Hanks緩冲盐溶液(HBSS )中4 ju g/ml Calcein AM的新24孔 平板中，在37。C、 5Q/oC02聘育l小时。BD FluoroBlok膜仅容许侵入通 过BD MatrigelTM膜的标记的细胞在荧光显微镜下显现。这个分析的结果 显示Cyr61的过量表达提高了侵入性(数据未显示)。
因而，Cyr61涉及与侵略性癌症中发现的相符的细胞表型的 发育。参考文献在此和整个说明书中引用的参考文献通过引用将它们合并在此。1. Evtimova V, Zeillinger R, Weidle UH. Identification of genes associated with the invasive status of human mammary carcinoma cell lines by transcriptional profiling Tumour Biol. 2003 Aug-Sep;24 ( 4 ) :189-98.2. Planque N, Perbal B. A structural approach to the role of CCN (CYR61/CTGF/NOV) proteins in tumourigenesis. Cancer Cell Int. 2003Aug22;3 ( 1 ) :15.3. Menendez JA, Mehmi I, Griggs DW, Lupu R The angiogenic factor CYR61 in breast cancer: molecular pathology and therapeutic perspectives. Endocr Relat Cancer. 2003 Jun;lO ( 2 ) :141-52. Review.4. Tsai MS, Bogart DF, Castaneda JM, Li P, Lupu R. Cyr61 promotes breast tumorigenesis and cancer progression. Oncogene. 2002 Nov 21;21 ( 53 ) :8178-85.5. Tsai MS, Bogart DF, Li P, Mehmi I, Lupu R. Expression and regulation of Cyr61 in human breast cancer cell lines. Oncogene. 2002 Jan 31;21 (6) :964-73.6. Tsai MS and Ruth Lupu. An angiogenic factor, in breast cancer tumor progression. International Journal of Molecular Medicine, 2000, 6: S22 Abstract,7. Xie D, Miller CW, O'Kelly J, Nakachi K, Sakashita A, Said JW,Gornbein J, Koeffler HP. Breast cancer. Cyr61 is overexpressed, estrogen-inducible, and associated with more advanced disease.8. J Biol Chem. 2001 Apr 27;276 ( 17) :14187-94. pub 2001 Jan 31.9. Xie D, Nakachi K, Sakashita A., Higashi, Miller CW, and Phillip Koeffler. CYR61, an angiogenic induce, is overexpressed and estrogen inducible in breast cancer. Proc. Amer. Assoc, for Cancer Research, 2000， 41: 338. Abstract10. Tsai等人，Cyr61 induces breast tumorigenicity and promotes breast cancer progression through regulation of the MAPK and AKT signaling pathways. Proc. Amer. Assoc, for Cancer Research, 2002,43: 673. Abstract11. Perbal等人，Report on the second international workshop on the CCN family of genes. J. Clin. Pathol: Mol Pathol. 2003， 56: 80-85.12. Cayer-Lelievre等人，Report on the first international workshop on the CCN family of genes J. Clin. Pathol: Mol Pathol. 2001, 54: 105-107.
权利要求
1.用于促进个体的上皮来源的癌症的诊断的方法，所述方法包括a.测量在获自所述个体的测试尿液样品中存在的Cyr61水平；b.比较所述测试尿液样品中的Cyr61水平和对照尿液样品中存在的Cyr61水平；其中与对照样品中Cyr61水平相比在测试样品中更高的Cyr61水平是上皮来源的癌症的指示。
2. 用于怀疑患有或患有上皮来源的癌症的个体的预后评估的方 法，所述方法包括a. 测量在获自所述个体的测试尿液样品中存在的Cyr61水平来获得第 一样品；b. 比较步骤(a)中确定的水平和在更晚的时点获自同一个体的尿 液样品中的Cyr61水平；以及c. 根据步骤(b)中的比较来评估所述患者的预后，其中在更晚的 时点获自同一个体的尿液样品中更高的Cyr61水平指示发展更为侵略性 形式的癌症。
3. 权利要求l-2任一项的方法，其中所述上皮来源的癌症选自乳腺 癌、基底细胞癌、腺癌、胃肠癌、唇癌、口腔癌、食道癌、小肠癌症、 胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肺癌、皮 肤癌、前列腺和肾脏细胞癌。
4. 权利要求l-2任一项的方法，其中Cyr61蛋白的水平通过包括以 下步骤的方法来测量a. 用特异性结合Cyr61的基于抗体的结合部分接触所述测试样品 或其制备物来形成抗体-Cyra复合物；以及b. 检测所述复合物的存在，从而测量存在的Cyr61的水平。
5. 根据权利要求4的方法，其中使用可检测的标记物来标记所述基 于抗体的结合部分。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述标记选自放射性标记物、半抗 原标记物、荧光标记物和酶标记物。
7. 根据权利要求4的方法，其中所述基于抗体的结合部分是抗体。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
9. 用于检测尿液样品中的Cyr61的试剂盒，其包含容纳尿液样品的容器，和至少一种特异性结合Cyr61的抗体。
10. 权利要求9的试剂盒，其中所述试剂盒包含特异性结合Cyr61 的两种抗体， 一种抗体固定在固相上， 一种抗体#皮可4企测地标记。
11. 根据权利要求9的试剂盒，其还包括使用说明书。
12. —种指导个体的治疗的方法，其包括让个体测试获自所述个体 的尿液样品中的Cyr61水平，其中临床医师审查该结果，如果个体的尿 液样品具有比对照样品中的Cyr61水平更高水平的Cyr61,所述临床医 师指导所述个体治疗上皮来源的癌症。
全文摘要
尿液Cyr61蛋白水平在患有上皮来源癌症例如乳腺癌和卵巢癌的患者中被增量调节。因此，本发明涉及上皮来源的癌症的预后评估和诊断的方法。进一步的，在尿液样品中检测的Cyr61蛋白的数量与疾病状况相关，从而Cyr61水平可以用于预测癌症的存在以及转移可能性。因而，测量尿液中的Cyr61水平提供了快速、简单和安全的筛选，其可以用于患者中癌症的诊断和预后。
文档编号G01N33/53GK101120252SQ200680005158
公开日2008年2月6日 申请日期2006年2月17日 优先权日2005年2月18日
发明者B·张, M·A·摩西 申请人:儿童医疗中心有限公司