本发明涉及AD生物标记物技术领域，尤其涉及一种AD生物标记物及其检测方法。
背景技术：
阿尔茨海默症，简称AD (Alzheimer's Disease)，是一类神经退行性疾病，主要发作于65 岁以上老年人群中，全世界超过7000万人患有不同程度痴呆，其中阿尔茨海默病超过50%，每年用于痴呆防治上的费用高达3150美元。在欧美主要城市人群中AD是仅次于癌症的第二大隐患，在我国1984~2004年60岁以上人口发病率为1.6％，患者总数已超过500万。在各种易患因素中，年龄是AD最重要的影响因素，在65岁以上人群中，AD的发生率约为5.4%，且发病呈年轻化趋势。AD患者的症状体征主要表现为起病隐匿、记忆障碍、认知障碍及精神障碍等，呈进行性不可逆进展，根据认知能力和身体机能的恶化程度分成三个时期，第一阶段（1~3年）为轻度痴呆期，第二阶段（2~10年）为中度痴呆期，第三阶段（8~12年）为重度痴呆期，该期患者完全失去生活能力，严重时引起并发症导致死亡。随着全球人口老龄化进程加快，其发病率愈来愈高，给患者、家庭和社会带来沉重负担。
AD病理学上以神经炎性斑( NPs) 又称老年斑( SPs) 、神经原纤维缠结( NFTs)和脑血管淀粉样变性( CAA) 为典型病理特征，脑组织内淀粉样蛋白质片段异常增加或聚集是导致神经元死亡的主要原因。针对 β 淀粉样蛋白（amyloid β, Aβ）为靶点的有关疫苗的临床试验均以失败告终，提示多靶点干预AD 的重要性，目前AD无法治愈，阿尔茨海默病的早期诊断对其预防和治疗起着关键性的作用，同时新型生物标志物的发现与应用有助于揭示新的治疗靶点及AD 新药的临床评价。
目前临床上已应用的AD生物标志物及检测技术非常有限，主要包括反映Aβ聚集情况的脑脊液(CSF) Aβ42浓度，以及总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的水平来作为AD生物标志物。疾病中晚期实施的药物干预与治疗难以逆转病情，效果甚微，尽管目前有很多药物治疗，但并不能显著改善临床症状和疾病生理发展进程。轻度认知障碍是介于正常化和痴呆之间的一种临床状态，因其发病率高、缺乏有效敏感的早期诊断指标、易漏诊和误诊成为防治AD的难点问题。当前临床上对AD的鉴别和诊断，主要依靠以临床症状为基础的体检、辅助检查和神经心理测试等方法。其实，在临床症状出现之前的5~10年，AD的病理改变已经发生，因此，阿尔茨海默病的早期诊断是预防和延缓AD病程的有效途径。
蛋白质组学技术可以检测到系统蛋白质表达水平、结构，提供蛋白质的修饰信息，以及蛋白之间的相互作用，可高通量识别样本中的蛋白质并对其含量进行分析，因为蛋白质组学的这些特性，它在分子疾病表型，寻找药物靶点和临床诊断生物标志物提供了一个综合而广泛的路径。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种AD生物标记物及其检测方法，旨在解决现有AD生物标记物应用受到限制和检测结果变动很大的问题。
本发明的技术方案如下：
一种AD生物标记物，其中，所述AD生物标记物包括表达量上调蛋白和表达量下调蛋白中的一种或两种；
所述表达量上调蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一种或多种；
所述表达量下调蛋白包括Cystatin-C、Histone H2A、Histone H2B 、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一种或多种。
所述的AD生物标记物，其中，所述AD生物标记物为表达量上调蛋白；
所述表达量上调蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一种或多种。
所述的AD生物标记物，其中，所述AD生物标记物为表达量下调蛋白；
所述表达量下调蛋白包括Cystatin-C，Histone H2A、Histone H2B 、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一种或多种。
所述的AD生物标记物，其中，所述AD生物标记物包括表达量上调蛋白和表达量下调蛋白；
所述表达量上调蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一种或多种；
所述表达量下调蛋白包括Cystatin-C、Histone H2A、Histone H2B、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一种或多种。
所述的AD生物标记物，其中，所述AD生物标记物包括表达量上调蛋白和表达量下调蛋白；
所述表达量上调蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11和Alpha-2-macroglobulin；
所述表达量下调蛋白包括Cystatin-C、Histone H2A、Histone H2B 、Tubulin alpha-1B和Annexin A3。
一种AD生物标记物的检测方法，其中，采集唾液，采用ITRAQ蛋白质组学分析技术，检测唾液中是否存在如上任一所述的AD生物标记物。
有益效果：本发明上述蛋白的任意组合均可以作为AD生物标记物，该AD生物标记物均能准确地反映AD病理发展状况，实现对AD的早期诊断。
具体实施方式
本发明提供一种AD生物标记物及其检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种AD生物标记物，其中，按照表达量改变程度的不同，所述AD生物标记物可分为两组：表达量上调蛋白（表达量增加，上调）和表达量下调蛋白（表达量下降，下调），即本发明所述AD生物标记物包括表达量上调蛋白和表达量下调蛋白中的一种或两种；
具体地，所述表达量上调蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E（蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺基转移酶E） 、Protein S100-A12（S100-A12蛋白）、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1（α-2-巨球蛋白-样蛋白1）、Polymeric immunoglobulin receptor（聚合免疫球蛋白受体）、Myeloperoxidase（髓过氧化物酶）、Peroxiredoxin-1（过氧物毒素-1）、Protein S100-A11（S100-A11蛋白）、Alpha-2-macroglobulin（α-2-巨球蛋白）中的一种或多种；
具体地，所述表达量下调蛋白包括Cystatin-C（胱胺酸蛋白酶抑制剂C）、Histone H2A（组蛋白H2A）、Histone H2B（组蛋白H2B） 、Tubulin alpha-1B（微管蛋白α-1B）、Annexin A3（膜联蛋白A3）中的一种或多种。
换句话说，本发明确定了用于诊断AD的生物标记物，AD生物标记物为以上13种表达差异蛋白中的一种或多种蛋白的组合：8种表达量上调蛋白和5种表达量下调蛋白。本发明上述蛋白的任意组合均可作为AD生物标记物，其均能准确地反映AD病理发展状况，实现对AD的早期诊断。
作为优选实施例，所述AD生物标记物为表达量上调蛋白；所述表达量上调蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一种或多种。本发明上述表达量上调蛋白中的一种或多种可以作为AD生物标记物，检测上述表达量上调蛋白中的一种或多种的表达量变化情况，根据表达量变化情况即可实现对AD的早期诊断。
作为另一优选实施例，所述AD生物标记物为表达量下调蛋白；所述表达量下调蛋白包括Cystatin-C，Histone H2A、Histone H2B 、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一种或多种。即本发明上述表达量下调蛋白中的一种或多种同样可作为AD生物标记物，检测上述表达量下调蛋白中的一种或多种的表达量变化情况，即可实现对AD的早期诊断。
作为另一优选实施例，所述AD生物标记物包括表达量上调蛋白和表达量下调蛋白；
所述表达量上调蛋白包括Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E 、Protein S100-A12、Alpha-2-macroglobulin-like protein 1、Polymeric immunoglobulin receptor、Myeloperoxidase、Peroxiredoxin-1、Protein S100-A11、Alpha-2-macroglobulin中的一种或多种；
所述表达量下调蛋白包括Cystatin-C、Histone H2A、Histone H2B、Tubulin alpha-1B、Annexin A3中的一种或多种。即本发明将上述表达量上调蛋白和表达量下调蛋白作为蛋白质组，以该蛋白质组作为AD生物标记物，该AD生物标记物同样可实现对AD的早期诊断，并能够提高诊断的准确度。
本发明还提供一种AD生物标记物的检测方法，其中，采集唾液，采用ITRAQ蛋白质组学分析技术，检测唾液中是否存在如上任一所述的AD生物标记物。
本发明通过ITRAQ蛋白质组学分析技术，检测唾液中是否存在如上任一所述的AD生物标记物，若存在则表明为AD患者，若不存在则表明为健康。本发明将上述表达差异蛋白中的任意一种或一种以上以组合作为AD检测标志物，用于临床诊断，可极大提高诊断特异性和准确性。本发明中唾液的采集快速简单，与脑脊液取样相比创伤性小、安全性高。与AD的影像学检测方法如PET检测相比，对患者无毒副作用，且具有定量检测的效果。
本发明检测AD唾液中蛋白的表达量变化情况，与目前临床使用的量表检测及影像学诊断相比，人为主观性降低，更为准确，而且具有定量检测的效果。
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
（1）唾液中蛋白的提取
1、样品分类，15例AD患者唾液和15例年龄匹配的正常对照组唾液，做好标记。
2、12000r 4℃离心10min ，吸取上清。
3、将取450ul上清加入10KD超滤管的柱子中，11000r离心20min，重复3-4次，注意将柱子上的液体离心干净。
4、取200ul 50mM Tris-Hcl（（羟甲基）氨基甲烷）清洗，11000r离心20min，重复2次。
5、加入200ul 50mM Tris-Hcl溶解离心分离出的蛋白。
6、BCA定量测定蛋白浓度。
7、取出100ug蛋白至新的EP管（塑料管）中，剩余的不动，封口，冻干。
（2）唾液蛋白酶切步骤
1．按蛋白定量结果向1.5mL的离心管中加入100μg唾液蛋白，用Buffer（缓冲液）定容体积至40 μL，并做好标记。向每管样品中加入4倍体积（160 μL）的还原剂，充分涡旋混匀，短时离心将粘在管壁上的蛋白溶液离到管底，然后37℃水浴（或者恒温振荡器400rpm）1.5 h。
2．取出样品后进行短时离心，加入与还原剂等体积（160 μL）的烷基化试剂，涡旋混匀，室温避光放置15 min。
3．取新的超滤管做好标记，然后将烷基化后的样品转移至对应的超滤管中，4℃，11500 rpm（10000g）30min，将未反应液体全部离心下去（废液）。
4．向每个超滤管中加入150 μL TEAB溶液（ 四乙基溴化铵溶液），4℃，11500 rpm（10000g），30min，直至超滤管中的液体全部离心下去，重复3~4次。
5．吸尽管底的废液，加入400μLH2O将超滤管洗净，然后倒掉液体，向每管中加入100 μL 配制好的酶解液，37℃水浴过夜15h。
6. 取出酶解好的蛋白样品，室温下11500rpm，离心10min，再加入100ulTEAB溶液(确认不含尿素)，室温下11500rpm，离心5 min，重复一次。
7. 将过滤得到的液体转移至干净新离心管中，做好标记，封口膜封好，再用针在膜上扎些小孔，将其置冷冻干燥浓缩仪里过夜冻干。
8. 取出冻干的样品，向其中加入30μL TEAB（不含尿素）使其浓度为1 μg/μL，并充分涡旋混匀。
9. iTRAQ试剂的准备：确保样品的pH呈碱性一般为8左右，用异丙醇溶解iTRAQ试剂，是最终的反应体系中有机溶剂的比例大于65%，一般为70%。从-20℃冰箱中取出试剂，向每管中加入70 μL异丙醇，充分涡旋混匀，离心，重复1次。
10. 取混匀离心后的iTRAQ试剂分别加入到含30μL蛋白样品的离心管中，涡旋混匀，离心，于室温下放置2 h。
11. 反应结束后向每管中加入100μL色谱纯水终止反应30 min。
12 将终止反应的液体离心后转移至一个管中混匀，将其转移至冷冻干燥机中过夜冻干。
13 取出冻干样品，加100ul水溶解均匀，液相色谱分离，将所得溶液于冷冻干燥机冻干。
14 液相色谱串联质谱鉴定，质谱采集到的原始wiff图谱文件，采用Protein Pilot Software v. 4.5(AB SCIEX, USA)软件进行数据加工处理和检索分析。
（三）结果
将15例AD患者和15例年龄匹配的正常对照组唾液进行ITRAQ蛋白质组学分析后，发现AD组相比于健康对照组有8个明显上调的蛋白，分别为：Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E ，Protein S100-A12，Alpha-2-macroglobulin-like protein 1，Polymeric immunoglobulin receptor，Myeloperoxidase，Peroxiredoxin-1，Protein S100-A11，Alpha-2-macroglobulin.，5个明显下调的蛋白：Cystatin-C，Histone H2A，Histone H2B ，Tubulin alpha-1B，Annexin A3。
综上所述，本发明提供一种AD生物标记物及其检测方法，本发明通过ITRAQ蛋白质组学分析技术，检测唾液中是否存在上述表达差异蛋白，将上述表达差异蛋白中的任意一种或一种以上以组合作为AD检测标志物，用于临床诊断，可极大提高诊断特异性和准确性。本发明中唾液的采集快速简单，与脑脊液取样相比创伤性小、安全性高。与AD的影像学检测方法如PET检测相比，对患者无毒副作用，且具有定量检测的效果。本发明检测AD唾液中蛋白的表达量变化情况，与目前临床使用的量表检测及影像学诊断相比，人为主观性降低，更为准确，而且具有定量检测的效果。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。