本发明涉及一种细菌检测方法，具体是一种食品中志贺氏菌的检测方法。
背景技术：
志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌，是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌。细菌性痢疾是最常见的肠道传染病,夏秋两季患者最多。传染源主要为病人和带菌者,通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染。人类对志贺氏菌易感，10～200个细菌可使10～50%志愿者致病。一般说来，志贺氏菌所致菌痢的病情较重。急性细菌性痢疾多见于小儿，各型痢疾杆菌都可引起。发病急，常在腹痛、腹泻未出现，呈现严重的全身中毒症状。急性菌痢治疗不彻底，或机体抵抗力低、营养不良或伴有其他慢性病时，易转为慢性。病程多在二个月以上，迁延不愈或时愈时发。
目前食品中志贺氏菌的传统检测方法主要依据国家标准GB 4789.5-2012，需要厌氧培养、分离、筛选和生化鉴定，检测结果虽准确，但操作繁琐、检测周期长，满足不了快速检测的需求。分子生物学技术因具有检测灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，在食源性致病菌的检测中发挥了巨大的作用，也被应用于志贺氏菌的检测。随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。
同时传统检测志贺氏菌的培养方法,需要分离、筛选和生化鉴定,必要时还需要血清学鉴定,一般为4～6d,费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺点。各种常规PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点,有较多应用于志贺氏菌检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。因此焏待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床检验方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便的食品中志贺氏菌的检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种食品中志贺氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到TSB胰蛋白胨大豆肉汤中，培养温度为30-40℃，培养时间为20-28h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1μL，SYBER Green I荧光染料 0.1μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 10U，甜菜碱溶液 0.5μL，硫酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，IPTG 2μL，谷氨酸溶液 2μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述SYBER Green I荧光染料为120-150倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甜菜碱溶液的浓度为2-6mmol/L；
所述硫酸钠溶液的浓度为10-20mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；
所述谷氨酸溶液的浓度为70-90mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，92-96℃变性4-6min，92-96℃变性0.5-1.5min；50-70℃退火20-40s；68-76℃延伸0.5-1.5min；32个循环，最后68-74℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（1）中培养温度为35℃，培养时间为24h。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述SYBER Green I荧光染料为135倍稀释。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述甜菜碱溶液的浓度为4mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述硫酸钠溶液的浓度为15mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（2）中所述谷氨酸溶液的浓度为80mmol/L。
作为本发明进一步的方案：具体步骤（3）中94℃变性5min，94℃变性1.0min；60℃退火3s；72℃延伸1.0min；32个循环，最后71℃延伸10min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理；（2）构建恒温扩增反应体系；（3）荧光定量反应；（4）检测分析。本发明的检测方法灵敏度高，特异性和敏感性强，对模板DNA要求较低，耗时短，方法简便。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种食品中志贺氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到TSB胰蛋白胨大豆肉汤中，培养温度为30℃，培养时间为20h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1μL，SYBER Green I荧光染料 0.1μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 10U，甜菜碱溶液 0.5μL，硫酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，IPTG 2μL，谷氨酸溶液 2μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；
所述SYBER Green I荧光染料为120倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甜菜碱溶液的浓度为2mmol/L；
所述硫酸钠溶液的浓度为10mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；
所述谷氨酸溶液的浓度为70mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，92℃变性4min，92℃变性0.5min；50℃退火20s；68℃延伸0.5min；32个循环，最后68℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例2
一种食品中志贺氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到TSB胰蛋白胨大豆肉汤中，培养温度为33℃，培养时间为22h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1μL，SYBER Green I荧光染料 0.1μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 10U，甜菜碱溶液 0.5μL，硫酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，IPTG 2μL，谷氨酸溶液 2μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；
所述SYBER Green I荧光染料为130倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甜菜碱溶液的浓度为3mmol/L；
所述硫酸钠溶液的浓度为12mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；
所述谷氨酸溶液的浓度为70mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，93℃变性4min，93℃变性0.8min；55℃退火25s；70℃延伸1.0min；32个循环，最后69℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例3
一种食品中志贺氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到TSB胰蛋白胨大豆肉汤中，培养温度为35℃，培养时间为24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1μL，SYBER Green I荧光染料 0.1μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 10U，甜菜碱溶液 0.5μL，硫酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，IPTG 2μL，谷氨酸溶液 2μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8；
所述SYBER Green I荧光染料为135倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甜菜碱溶液的浓度为4mmol/L；
所述硫酸钠溶液的浓度为15mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8；
所述谷氨酸溶液的浓度为80mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，94℃变性5min，94℃变性1.0min；60℃退火30s；72℃延伸1.0min；32个循环，最后71℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例4
一种食品中志贺氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到TSB胰蛋白胨大豆肉汤中，培养温度为38℃，培养时间为27h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1μL，SYBER Green I荧光染料 0.1μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 10U，甜菜碱溶液 0.5μL，硫酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，IPTG 2μL，谷氨酸溶液 2μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.9；
所述SYBER Green I荧光染料为140倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甜菜碱溶液的浓度为5mmol/L；
所述硫酸钠溶液的浓度为18mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.9；
所述谷氨酸溶液的浓度为85mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性6min，95℃变性1.3min；65℃退火35s；74℃延伸1.3min；32个循环，最后72℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
实施例5
一种食品中志贺氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以志贺氏菌ipaC基因特异序列为靶序列，SYBER Green I为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：
（1）预处理：
在无菌环境下，将食品加入到TSB胰蛋白胨大豆肉汤中，培养温度为40℃，培养时间为28h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取总DNA；
（2）构建恒温扩增反应体系：
DNA模板 1μL，SYBER Green I荧光染料 0.1μL，10×Buffer 3.0μL，DNA聚合酶 10U，甜菜碱溶液 0.5μL，硫酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 3μL，IPTG 2μL，谷氨酸溶液 2μL，其余用dd H2O补足至30μL；
所述DNA模板的OD260/OD280值为1.9；
所述SYBER Green I荧光染料为150倍稀释；
所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH 8.3）、蔗糖；
所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；
所述甜菜碱溶液的浓度为6mmol/L；
所述硫酸钠溶液的浓度为20mmol/L；
所述DNA引物的OD260/OD280值为1.9；
所述谷氨酸溶液的浓度为90mmol/L；
（3）荧光定量反应：
将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，96℃变性6min，96℃变性1.5min；70℃退火40s；76℃延伸1.5min；32个循环，最后74℃延伸10min；
（4）检测分析：
根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。