专利名称：：一种检测转基因食品的复合基因芯片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及本发明属于食品安全领域，涉及一种检测食品中转基因植物的复合基因芯片。
背景技术：
：自世界首例转基因烟草于1983年问世至今，科学家们已成功实现200多种植物的基因转移，创造出具有丰产、优质、抗病虫、抗除草剂、抗旱、抗寒、抗盐碱等优良性状的植物新品种。随着转基因植物种类的增多，种植面积的扩大以及商品化速度的明显加快，其安全性越来越受到关注。1998年，ArpadPusata教授在电视上公布未发表的研究结果宣布转雪花莲凝集素(GNA)基因的马铃薯对试验老鼠的肝、胃和免疫系统都会造成伤害。1999年5月，英国《自然》杂志刊登美国康奈尔大学昆虫学副教授约翰罗西的一篇论文，论文说抗虫害Bt转基因玉米的花粉含有毒素，蝴蝶(黑脉金斑蝶)幼虫啃食撒有这种花粉的苦苣菜叶后发育不良，死亡率特别高。这一结果被《纽约时报》、《华尔街日报》等报刊在显著位置转载，从而引发了“转基因玉米对生态环境是否安全”的争议。2006年底，法国绿色和平组织公布的一份报告显示，转基因大米的灾难突现，全球纷纷抗议转基因大米给人类带来的危机，世界上所有大出口商、大加工商和大供货商都抵制转基因大米的贸易，随即使全球大米工业蒙受的损失高达1.5亿美圆。2008年欧盟从中国进口的大米中检出Bt63转基因大米成分，随即2月欧盟决定对中国出口的大米及其米制品采取保障性措施，要求由中方认可的实验室按照欧盟提供的检验方法，对出口产品实施检测，并出具统一的卫生证书。目前，对转基因生物安全评价主要集中在环境安全性和食用安全性两个方面。环境安全性评价的核心问题是转基因生物是否会将所转基因再转移到其它生物中，会不会破坏生态环境，打破原有生物种群的动态平衡。食用安全性主要包括营养成分、抗营养因、毒性和致敏性等。对转基因生物安全，各界持不同的态度。国际组织及各国对转基因食品的管理日趋完善，FDA和WHO制订国际安全标准，实行消费者知情权原则(加施GMO标签)。欧洲议会于1997年5月通过了《新食品规程》的决议，规定欧盟国对上市的转基因食品必须要有基因改良体(GMO)的标签，包括所有转基因食品或含有转基因成份的食品。我国对转基因食品在管理上持谨慎态度，1992年卫生部颁布了《新资源食品卫生管理办法》。1993年原国家科委颁布了《基因工程安全管理办法》，要求对转基因生物进行安全性评价，制定安全控制方法和措施。1996年农业部颁布了《农业生物基因工程安全管理实施办法》，2001年，我国又颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，并制定了《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》。相对于转基因食品(GMO)，转基因检测技术的研究略显滞后。转基因产品的检测方法要求快速、准确、灵敏，适应样品量大、目标基因种类繁多等特点。由于GMO的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分部分或完全降解，所以检测难度很大。转基因检测方法的研究开始于1996年，有关转基因产品检测方法标准的研究，在世界范围内尚处在起步阶段。转基因检测方法主要有两种，即检测是否有外源蛋白质(基因表达的产物)和是否有外源基因(DNA)。以外源蛋白为检测目标的检测方法是根据免疫化学的原理，针对某一个特定外源基因表达产物而设计的，通过抗体与抗原的特异识别进行检测。目前主要有三种方法，即Western杂交、醇联免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)禾口侧、流法(LateralFlow)。这些方法灵敏度较高，但都仅针对一种特异蛋白，检测通量低；对于加工后的食品，目标蛋白构象改变，则无法检测；有些外源基因并不产生表达产物，如延熟西红柿。另外，蛋白存在特异部位表达问题，如NoertisBtl76玉米，外源蛋白只在叶片部位表达，在籽粒几乎找不到。以DNA为检测目标的方法包括Southern杂交法、PCR以及基因芯片法。Southern准确度高、特异性强，但杂交程序复杂，成本高，且对实验技术条件要求较高。PCR法有很多类型，目前已用于转基因检测的有定性PCR、半定量PCR、竞争性PCR和实时PCR等方法。其中实时PCR法能有效地扩增低拷贝的靶片段DNA，可检测到每克样品含有20pg-10ng的转基因成分。基因芯片技术是近十几年来在生命科学领域迅速发展起来的一项高新技术。其原理是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有序地、高密度地排列固定于支持物上，待测的样品核酸分子经标记，与固定在载体上的DNA阵列中的点进行杂交，通过杂交信号判断检测结果。基因芯片技术具有高通量、平行化、微量化、自动化等优点。目前尚无任何一个品系的转基因大米被获准商业化生产，而检验检疫系统也无相应的行业及国家标准进行检测。
发明内容本发明的目的是为了提供一种特异性高、重复性好、快速可靠的检测转基因食品的体系，为转基因产品的检测提供一强力有效的手段。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种检测转基因食品的复合基因芯片，其特征在于，芯片把转基因检测的8个靶基因tRNALeu、Gos、Lectin、Nos、CrylAb/c、Btc、CaMV35s、CP4EPSPS整合于同一张芯片上，其中各靶基因的探针分别为GGAATTAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAA；TCCCGCTGCAGAGCGGCAGTGTGGTTGGTTTCTTCGGACGCGCGG；CACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCC；GATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTC；TTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCAT；TTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGG；CTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAG；CGATCACCTACCGCGTGCCGATGGCCTCCGCACAGGTGAAGTCCG。其中，所述的靶基因对应的引物分别为正CGAAATCGGTAGACGCTACG反TTCCATTGAGTCTCTGCACCT；正TTAGCCTCCCGCTGCAGA反AGAGTCCACAAGTGCTCCCG；正CCTCCTCGGGAAAGTTACAA反GGGCATAGAAGGTGAAGTT；正ATCGTTCAAACATTTGGCA反ATTGCGGGACTCTAATCATA；正GGGAAATGCGTATTCAATTCAAC反TTCTGGACTGCGAACAATGG；正GACTGCTGGAGTGATTATCGACAG反AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG；正GATAGTGGGATTGTGCGTCA反GCTCCTACAAATGCCATCA；正CCGACGCCGATCACCTA反GATGCCGGGCGTGTTGAG。其中，所述基因芯片采用硅基生物传感器芯片。本发明针对转基因产品的内源基因和转入的外源基因设计相应的引物及寡核苷酸探针，进行PCR扩增，构建基因芯片检测体系，通过扩增靶基因上标记的生物素的显色反应形成杂交信号，建立检测转基因产品的基因芯片快速检测体系，并且能用于所有植物性转基因产品Nos终止子及CaMV35s启动子的筛选检测。该体系特异性高、重复性好、快速可靠，为转基因大米及大豆产品的检测提供又一强有力手段。图1转基因大米检测靶基因的PCR扩增电泳图；(M=DNAMarkerDL2000(分子量从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)；1=Gos；2:Nos(rice)；3=Btc；4:CrylAb/c；5:tRNALeu(rice))图2转基因大豆检测靶基因的PCR扩增电泳图；(M=DNAMarkerDL2000(分子量从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、IOObp)；1=Lectin；2:Nos(soybean)；3=CaMV35S；4:tRNALeu(soybean)；5:CP4EPSPS)图3基因芯片点样阵列示意图；图4转基因大米BT63芯片杂交图；图5转基因大豆RRS芯片杂交图；图6转基因玉米BTll芯片杂交图；图7转基因玉米M0N810芯片杂交图；图8转基因玉米NK603芯片杂交图；图9抗草甘瞵转基因油菜籽芯片杂交图；图10非转基因大米芯片杂交图；图11非转基因大豆芯片杂交图；图12非转基因油菜籽芯片杂交图。具体实施例方式一、探针和引物的设计根据检验检疫行业对转基因大米及大豆检测的需要，共选择了8个靶基因，分别为tRNALeu、Gos、Lectin、Nos,CrylAb/c、Btc、CaMV35s、CP4EPSPS。设计选用8对引物和8条探针。引物及探针的相关信息详见表2。二、转基因大米基因芯片的构建1、阵列设计阵列排布示意图如图3和表1，列阵包括检测寡核苷酸探针点(B1-B4，C1-C4，D1-D4，E1-E4)，阴性对照点(点A1-A4)及芯片质控点(点A5-E5)。共8条寡核苷酸探针，每条点2个重复点。芯片质控点为生物素标记的polyA，除用于芯片的质控外还起到列阵定位的作用。当然，所述阵列可以根据需要任意的随机排列。表1基因芯片点样列阵示意表‘<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2靶基因引物的相关信息<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注tRNALeu植物叶绿体基因；Gos大米特异性基因；Lectin植物凝集素；Nos胭脂碱合成酶基因终止子；CrylAb/c苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白crylA(b)和CrylA(C)的融合基因；Btc转基因大米BT63品系特异性基因；CaMV35s来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子；CP4EPSPS:5_莽草酸_3_磷酸合；2、芯片点样及质控点样将寡核苷酸探针按所设计的列阵点于硅基生物传感器芯片上。将芯片镶嵌到芯片凹槽中。质控加入70μLBff于芯片凹槽室温反应lOmin，洗液B冲洗芯片后用洗耳球把凹槽中的水充分吹干，加入2滴TMB避光反应IOmin后用蒸馏水冲洗芯片，用洗耳球把多余水分吹干。若PolyA探针点产生杂交信号时表明本批次芯片可正常工作。二、基因芯片的样品检测1、靶基因的PCR扩增PCR反应体系见表3，PCR仪运行参数设置按常规进行。各引物扩增的退火温度参见表2。反应参数:95°C,2min；94°C，40s，引物退火温度(Tm)，60s，72°C，60s，35个循环；72°C,5min。反应结束后，扩增产物经3%的琼脂糖凝胶(含0.05μL/ml的EB)电泳检测，电泳缓冲液为ιχTAE,点样量5μL，电泳条件为100V，30min,用DL2000作为DNA标准分子量，紫外灯下检测电泳结果并拍照分析。(见图1和图2)表3靶基因PCR反应体系_6]_组分_体积(μL)模板DNA3.O5X反应混合物10.025ρπιο1/μL上游引物1.025pmol/uL下游引物1.0HS-Taq(5U/μL)1.0_灭菌三蒸水加至_500_--2、靶基因的芯片杂交试验1)PCR产物的变性吸取PCR产物15μL于0.2μLPCR管中，沸水煮IOmin后迅速置冰浴IOmin。2)杂交吸取10μL变性产物到芯片的凹槽，加入60μL的杂交缓冲液，置45°C水浴锅中杂交15min，于室温放置15min。洗液A冲洗芯片，用洗耳球把凹槽中的水分吹干。3)显色加入70μLBW于芯片凹槽室温反应lOmin，洗液B冲洗芯片后用洗耳球把凹槽中的水充分吹干，加入2滴TMB避光反应IOmin后用蒸馏水冲洗芯片，用洗耳球把多余水分吹干。结果判读并拍照。(结果见图4-图12)3、各种植物样品的芯片杂交试验PCR产物的沉淀浓缩将植物样品的各检测靶基因扩增后所得产物250μL集合到1.5mLEppendorf离心管中，加入2倍体积的无水乙醇、1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)，置于-20°C避光沉淀30min以上。沉淀后的PCR产物经12000rpm离心15min，弃上清，室温晾干，加50yLTE溶解。然后按照上述“2、靶基因的芯片杂交试验”的步骤进行实验。所用的转基因样品及非转基因样品样品靶基因的有关信息见表4。4、检测限试验称量转基因大米BT63的谷粒重量(本实验约为20mg)，将非转基因大米研细后称取5份，重量分别为200mg、400mg、2000mg、4000mg、20000mg，每份放入1粒转基因BT63大米后，分别研磨成粉末状并充分混勻，制成不同转基因含量的标准样品，含量分别为10%、5%U%>0.5%,0.1%。提取上述5个含量标准样品的DNA进行PCR扩增并进行芯片杂交，读取杂交信号，以能获得杂交信号的最低含量为该检测体系的检测限。5、重复性和稳定性试验选取不同批次和同一批次的芯片各5张，在相同的条件下与同批PCR产物进行杂交，验证该芯片体系的重复性及稳定性。四、试验结果1、各种植物样品的芯片杂交试验结果各种植物样品的芯片杂交试验结果也如图4-图12所示，表明靶基因的芯片杂交试验与各种植物样品的芯片杂交试验的一致性；同时，结果显示各检测靶基因杂交信号与理论数据一致(即表4)，表明该检芯片检测系统具有良好的可靠性。表4转基因样品及非转基因样品靶基因的有关信息<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、基因芯片检测转基因大米的灵敏度对不同含量的转基因大米标准品的DNA模板进行扩增之后与检测芯片进行杂交，杂交结果显示含转基因大米范围内，所有杂交斑点能被判读；当转基因大米含量为0.5%时，个别检测靶基因的杂交斑点无信号，或信号不稳定而不能被判读，表明该检测芯片用于转基因大米的检测灵敏度可达到1%。3、重复性和稳定性试验对不同批次3张和相同批次3张芯片在相同的条件下与同批PCR产物分别进行杂交，结果显示不同批次间和同一批次间的芯片的杂交信号强度存在一定的差异；但作为定性检测，这些差异对整个检测芯片结果判读没有影响。表明该芯片检测体系具有良好的重复性和稳定性。序列表<110><120>一种检测转基因食品的复合基因芯片<160>24<210>1<211>45<212>DNA<213>tRNALeu探针<400>1GGAATTAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAA<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25，CGAAATCGGTAGACGCTACG3，<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>35’TTCCATTGAGTCTCTGCACCT3’<210>4<211>45<212>DNA<213>Gos探针<400>4TCCCGCTGCAGAGCGGCAGTGTGGTTGGTTTCTTCGGACGCGCGG<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>55，TTAGCCTCCCGCTGCAGA3，<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>65，AGAGTCCACAAGTGCTCCCG3，<210>7<211>45<212>DNA<213>Lectin探针<400>7CACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCC<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>85，CCTCCTCGGGAAAGTTACAA3，<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>95，GGGCATAGAAGGTGAAGTT3，<210>10<211>45<212>DNA<213>Nos探针<400>10GATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTC<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>115，ATCGTTCAAACATTTGGCA3’<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>125，ATTGCGGGACTCTAATCATA3’<210>13<211>45<212>DNA<213>CrylAb/c探针<400>13TTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCAT<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>145，GGGAAATGCGTATTCAATTCAAC3，<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>155，TTCTGGACTGCGAACAATGG3，<210>16<211>45<212>DNA<213>Btc探针<400>16TTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGG<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>175’GACTGCTGGAGTGATTATCGACAG3’<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>185，AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG3’<210>19<211>45<212>DNA<213>CaMV35s探针<400>19CTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAG<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>205，GATAGTGGGATTGTGCGTCA3，<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>215'GCTCCTACAAATGCCATCA3'<210>22<211>45<212>DNA<213>CP4EPSPS探针<400>22CGATCACCTACCGCGTGCCGATGGCCTCCGCACAGGTGAAGTCCG<210>23<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>235，CCGACGCCGATCACCTA3，<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>245，GATGCCGGGCGTGTTGAG3，权利要求一种检测转基因食品的复合基因芯片，其特征在于，芯片把转基因检测的8个靶基因tRNALeu、Gos、Lectin、Nos、Cry1Ab/c、Btc、CaMV35s、CP4EPSPS整合于同一张芯片上，其中各靶基因的探针分别为GGAATTAAAAATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTGTTCAGAAA；TCCCGCTGCAGAGCGGCAGTGTGGTTGGTTTCTTCGGACGCGCGG；CACCCCAAAACCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCTACTCCACCCC；GATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTC；TTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCAT；TTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGG；CTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAG；CGATCACCTACCGCGTGCCGATGGCCTCCGCACAGGTGAAGTCCG。2.根据权利要求1所述的复合基因芯片，其特征在于所述的靶基因对应的引物分别为正CGAAATCGGTAGACGCTACG反:TTCCATTGAGTCTCTGCACCT；正TTAGCCTCCCGCTGCAGA反AGAGTCCACAAGTGCTCCCG；正CCTCCTCGGGAAAGTTACAA反GGGCATAGAAGGTGAAGTT；正ATCGTTCAAACATTTGGCA反ATTGCGGGACTCTAATCATA；正GGGAAATGCGTATTCAATTCAAC反TTCTGGACTGCGAACAATGG；正GACTGCTGGAGTGATTATCGACAG反AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG；正GATAGTGGGATTGTGCGTCA反:GCTCCTACAAATGCCATCA；正CCGACGCCGATCACCTA反:GATGCCGGGCGTGTTGAG。3.根据权利要求1、2所述基因芯片采用硅基生物传感器芯片。全文摘要本发明涉及一种检测转基因食品的复合基因芯片。本发明所述的基因芯片检测体系把转基因检测的8个靶基因整合于同一张芯片上，可同时检测食品中转基因大米和转基因大豆，还可以检测所有植物性转基因产品通用的Nos终止子及CaMV35s启动子。该芯片可用于食品中转基因成分检测，便捷快速，检测结果稳定可靠，准确性好，适应高通量快速检测的要求。文档编号C40B40/06GK101812512SQ200910214429公开日2010年8月25日申请日期2009年12月23日优先权日2009年12月23日发明者冯家望,周新朋,唐食明,梁玉英,王小玉,胡松楠,邝筱珊申请人:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局