一种检测海洋环境中γ-变形菌群落的基因芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种检测海洋环境中γ-变形菌群落的 基因芯片。
【背景技术】
[0002] γ -变形菌纲是海洋环境微生物中的主要类群，有研究表明，在一些自然生态灾害 (浒苔)暴发期间，γ-变形菌纲是相应近海岸地区最丰富的菌群，以青岛为例，浒苔暴发期 间青岛近岸环境中微生物种类的多样性很高，测定的种属中γ-变形菌纲占绝大多数，并且 其中的很多属在浒苔暴发前并未出现。这说明，γ-变形菌纲具有潜在的环境指示作用。另， 据象山港养殖区细菌群落与环境因子的影响研究表明，γ -变形菌的细菌在港底沉积物环 境中起着重要作用。如假单胞菌目能够同化co2和氧化硫化物，在碳、硫循环中起重要作用； Alteromonas sp.S属于γ-变形菌纲的交替单胞菌目，目前的报道中交替单胞菌属的细菌 有些属于海洋中的有益菌，而且这些有益菌在水产养殖中日益受到重视。Vibrio sp. 7G03 属于γ -变形菌纲的弧菌目，弧菌属有些种是海水养殖动物的重要致病菌之一，这种病具有 流行广、发病率高、死亡率高的特点，对于海域安全的治理具有指导意义。
[0003] 目前，海洋环境监测中的生物监测主要是对海洋环境中的浮游生物、底栖生物、潮 间带生物、游泳动物、大肠杆菌等生物种类组成和数量进行监测，缺少对海洋细菌群落的监 测。细菌复杂的群落结构、功能、相互作用和动态变化对海洋生态功能的维持有着重要意 义。微生物群落对环境变化响应快速，对污染具有指示作用。因此，增加对海洋环境各个细 菌种类组成和数量分布的监测，对建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系十分必 要。γ -变形菌是海洋环境中最为常见的细菌类群之一，对其组成和分布进行监测是海洋细 菌多样性监测的重要部分。
[0004] 目前传统的微生物监测主要是利用分离培养方法。这种监测方法繁琐、耗时，不适 合对多种细菌进行同时监测。亟需发展高通量、高效、便捷、低成本的海洋细菌群落监测技 术。基因芯片技术是采用原位合成或显微点样技术将大量DNA探针有序地固化于支持物上， 然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，获得样品的基因序列、基因表达信息 等遗传信息。具有高通量、并行性;采用荧光标记，检测的准确性高、检测时间短，可完全实 现自动化及快速检测。在芯片制备和结果检测以及信号分析、处理过程中采用计算机控制， 分析、检测结果更为客观、准确。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测海洋环境γ-变形菌群落的基因芯 片，即可平行、快速、高通量的检测海洋环境γ-变形菌群落，使基因芯片技术更好的应用于 海洋环境监测，以弥补现有检测技术的不足。
[0006] 本发明的基因芯片，包括有芯片载体，以及固定在芯片载体上的，用于检测海水中 的 Aeromonadaceae菌、AlcanivoracaceaeT^AlteromonadaceaeT^Chromatiaceaelif、 ColwelliaceaelMlNCoxiellaceaelMf NEctothiorhodospiraceae|Mf NEnterobacteriaceae |m[n Thiotrichaceae 菌、Xanthomonadaceae 菌、Hahellaceae 菌、Halomonadaceae 菌、 Idiomarinaceae |M1 NLegionel laceae |M1 NLitoricolaceae |M1 N0ceanospiri 1 laceae |M1 n ZooshikellalMf NVibrionaceae |M1 NMoraxellaceae |MfNThiotrichales_incertae_sedis |M1 n Pasteurellaceae菌、Piscirickettsiaceae菌、Pseudoalteromonadaceae菌、 Pseudomonadaceae菌、Psychromonadaceae菌、Sal inisphaeraceae菌、Shewane 1 laceae菌、 Sinobacteraceae菌、Ferrimonadaceae菌、Francisellaceae菌、Methylococcaceae菌的探 针。
[0007] 其中用于检测Aeromonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1-3中 的任一种或几种；
[0008] 其中用于检测Alcanivoracaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:4_6 中的任一种或几种；
[0009] 其中用于检测Alteromonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:7_9 中的任一种或几种；
[0010] 其中用于检测Chromatiaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDN0:10-12中 的任一种或几种；
[0011] 其中用于检测Colwelliaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDN0:13-15中 的任一种或几种；
[0012] 其中用于检测Coxiellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDNO:l6-l8中 的任一种或几种；
[0013] 其中用于检测Ectothiorhodospiraceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 19-21中的任一种或几种；
[0014] 其中用于检测Enterobacteriaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0: 22-24中的任一种或几种；
[0015] 其中用于检测Thiotrichaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0: 25-27 中的任一种或几种；
[0016] 其中用于检测Xanthomonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:28_ 30中的任一种或几种；
[0017] 其中用于检测Hahellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:31-33中的 任一种或几种；
[0018] 其中用于检测Halomonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:34_36 中的任一种或几种；
[0019] 其中用于检测Idiomarinaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:37-38 中的任一种或几种；
[0020] 其中用于检测Legionellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:39-41 中的任一种或几种；
[0021 ] 其中用于检测Litoricolaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:42-44 中的任一种或几种；
[0022] 其中用于检测Oceanospirillaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0: 45-47中的任一种或几种；
[0023] 其中用于检测Zooshikella菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:48-50中的 任一种或几种；
[0024] 其中用于检测Vibrionaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDN0:51中的一 种；
[0025] 其中用于检测Moraxellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQIDN0:52-54中 的任一种或几种；
[0026] 其中用于检测1'11；[01：1'；[(31^16 8_；[11061^36_86(1丨8菌的核酸探针，其核苷酸序列为 SEQ ID NO :55-57中的任一种或几种；
[0027] 其中用于检测Pasteurellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:58-60 中的任一种或几种；
[0028] 其中用于检测Piscirickettsiaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0: 61-63中的任一种或几种；
[0029] 其中用于检测Pseudoalteromonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 64-66中的任一种或几种；
[0030] 其中用于检测Pseudomonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:67_ 69中的任一种或几种；
[0031 ] 其中用于检测Psychromonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:70_ 72中的任一种或几种；
[0032] 其中用于检测Salinisphaeraceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:73_ 75中的任一种或几种；
[0033] 其中用于检测Shewanellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:76-78 中的任一种或几种；
[0034] 其中用于检测Sinobacteraceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:79-81 中的任一种或几种；
[0035] 其中用于检测Ferrimonadaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:82_84 中的任一种或几种；
[0036] 其中用于检测Francisellaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:85-87 中的任一种或几种；
[0037] 其中用于检测Methylococcaceae菌的核酸探针，其核苷酸序列为SEQ ID N0:88_ 89中的任一种或几种；
[0038] 在本发明的基因芯片上还固定有杂交阳性对照质控探针、杂交阴性对照质控探 针、表面化学质控探针中的任一种或几种，
[0039]其中杂交阳性对照质控探针(PC)的核苷酸序列为SEQ ID N0:90;
[0040]杂交阴性对照质控探针(NC)的核苷酸序列为SEQ ID N0:91;
[00411表面化学质控探针(CK)的核苷酸序列为SEQ ID NO:92,是一条用HEX染料标记的 40个T的寡核苷酸序列。这些荧光探针点的位置可作为芯片上DNA微阵列坐标，在芯片检测 过程中起到定位探针位置的作用。
[0042]本发明芯片所使用的探针可以快速、高通量地对海水中的γ-变形菌群落进行检 测，最大可以检测31个科的γ-变形菌信息，从而为海洋环境细菌群落的监测提供了有力的 技术支持，为建立、健全近岸海域海洋环境质量综合评价体系奠定了坚实的基础。
【附图说明】
[0043] 图1:本发明基因芯片的探针布局不意图。
[0044] 图2: γ-变形菌门群落基因芯片的特异性检测图(Francisellaceae科检测结果）。 [0045]图3:本发明基因芯片的应用图。
【具体实施方式】
[0046]下面结合实施例对本发明进行详细的描述，下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商所建