一种鉴定黄鳝物种及其产品的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定黄鳝物种及其产品的方法及专用片段与引物。
【背景技术】
[0002]黄鳝是天然性逆转动物，属于淡水硬骨鱼类，合鳃鱼目，合鳃鱼科。黄鳝在出生初期，即从胚胎期到初次性成熟时都是雌性(即体长在35厘米以下的个体的生殖腺全为卵巢)。在排卵之后，雌性性腺逐渐凋亡，雄性性腺逐渐发育，卵巢逐渐变为精巢;在经历一个特殊的时期一一兼性阶段(体长约为36?48厘米)以后，就会发育成完全的雄性(体长53厘米以上者则多为雄性)。整个性逆转的发育过程是单向的，完成性逆转的雌性个体不会再次发生性逆转过程。黄鳝这种天然的性逆转的现象，使得黄鳝成为了一个研究性别决定和性别发育的良好的模式物种，也使其在生物学、医学和农业上具有巨大的研究价值和经济效益。
[0003]黄鳝肉嫩味鲜，营养价值甚高。鳝鱼中含有丰富的DHA和卵磷脂，它是构成人体各器官组织细胞膜的主要成分，而且是脑细胞不可缺少的营养。故食用鳝鱼肉有补脑健身的功效。它所含的特种物质“鳝鱼素”，有清热解毒、凉血止痛、祛风消肿、润肠止血等功效，能降低血糖和调节血糖，对痔疮、糖尿病有较好的治疗作用，加之所含脂肪极少，因而是糖尿病患者的理想食品。鳝鱼含有的维生素A量高得惊人。维生素A可以增进视力，促进皮膜的新陈代谢。黄鳝不仅被当作名菜用来款待客人，近年来活运出口，畅销国外，更有冰冻鳝鱼远销美洲等地。黄鳝一年四季均产，但以小暑前后者最为肥美，民间有“小暑黄鳝赛人参”的说法。
[0004]但是由于黄鳝养殖较为困难且多以经验为主，黄鳝肉价格较高，因此市场上有部分假冒黄鳝肉进行销售，严重影响公民饮食健康。目前尚未有通过分子生物学方法鉴定黄鳝肉质的方法报道。
[0005]全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行个体的基因组测序。全基因组测序的方法是先提取基因组DNA，然后随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段(0.2?5Kb)，加上接头，进行基因簇cluster制备或电子扩增E-PCR，最后利用Paired-End(Solexa)或者Mate-Pair(SOLiD)的方法对插入片段进行测序。然后对测得的序列组装成Contig，通过Paired-End的距离可进一步组装成Scaffold，进而可组装成染色体等。组装效果与测序深度与覆盖度、测序质量等有关。常用的组装有:S0APdenOVO、Trimity、AbySS等。迄今尚未见关于黄鳝全基因组测序的相关文献。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种鉴定黄鳝物种的方法。
[0007]本发明提供的方法，为检测待测对象的基因组DNA，若基因组DNA中含有目的DNA分子，则所述待测对象为黄鳝。
[0008]所述目的DNA分子为Seq N0.1，外显子个数为1个，位置是chr5: 28889163-28889999ο
[0009]为实现上述目的，本发明通过对天然性逆转的硬骨鱼类黄鳝基因组进行测序，获得了黄鳝基因组框架草图，得到了基因组50倍的序列，Scaf f oldN50为967kb，组装Scaf f old为683M。进一步，我们通过基因组数据分析比较不同物种之间基因表达的差异筛选出黄鳝物种特异基因Seq N0.1，并由此确定和验证候选基因。通过NCBI网站blast搜索结果如图1，在其他物种中无任何同源基因。
[0010]上述检测待测对象的基因组DNA的方法为测序、PCR或分子杂交；
所述待测对象的基因组DNA来源于离体的待测对象的组织器官或血液。
[0011]本发明第三个目的是提供一种鉴定黄鳝物种的PCR试剂盒，包括引物组、dNTP、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶和水；
所述的引物组由引物1、引物2组成，可在Seq N0.1基因任意位置设计引物，
扩增所得PCR产物在其他物种中不存在。
[0012]优选地引物1的序列如Seq N0.2所示，引物2的序列如Seq N0.3所示。
[0013]上述PCR试剂盒在鉴定黄鳝物种或鉴别黄鳝肉质与其他食用鱼肉质中的应用。
[0014]本发明发明还提供一种鉴定黄鳝物种或鉴别黄鳝肉质与其他食用鱼肉质的方法，为用上述PCR试剂盒中的引物1 (Seq N0.2 )和引物2(Seq N0.3)对待测对象的样品组织的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测PCR扩增产物，若PCR扩增产物具有837bp大小的扩增产物，则待测对象为黄鳝物种或肉质为黄鳝肉质;若PCR扩增产物不具有837bp大小的扩增产物，则待测对象不为黄鳝物种或肉质不为黄鳝肉质。
[0015]所述的PCR扩增的退火温度具体为55-65 °C，优选为58 °C。
[0016]所述检测PCR扩增产物的方法具体为测序或电泳。
[0017]所述待测对象的基因组DNA为待测对象的肌肉组织基因组DNA。
[0018]本发明的技术方案提供了一段837bp的黄鳝物种特有的片段，根据该片段设计合成了 2条引物，用于PCR扩增，可以通过检测扩增产物是否含有该片段用来鉴定黄鳝物种。因此，本发明可实现经济、快速且高效的鉴别黄鳝物种，并且有助于黄鳝的科研和培育，及规范黄鳝肉类销售市场。
【附图说明】
[0019]图1是通过NCBI网站blast搜索结果，其中EEL000313.2是黄鳝物种特异的基因。左图是黄錯基因组中EEL000313.2序列在NCBI (Nat1nal Center for B1technologyInf ormat i on )数据库中比对结果;右图表示同源序列比对的物种。
[0020]图2是利用本发明所述引物在不同物种基因组中扩增所得片段电泳结果。从左到右依次为:泥鳅、草鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲢鱼、羊肉、猪肉、牛肉、鸡肉、黄鳝，条带大小为837bp。
【具体实施方式】
[0021]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0022]【实施例1】黄鳝物种特异基因的鉴定和克隆 1.序列比对。
[0023](1)将通过黄鳝全基因组测序得到的序列通过软件分析预测编码蛋白的基因序列，并通过分子生物学实验验证其准确性。
[0024](2)将编码蛋白的基因序列与已知物种(主要是鱼类)的基因序列进行比对，无法与现有物种比对上的即为黄鳝物种特有的基因组序列。
[0025]2.试剂配制。
[0026](l)SNET(PH8.0):Tris-HCl(PH8.0) 1.2114g、EDTA(PH8.0) 0.9306g、NaCl 11.688g、SDS 5g，加水至500ml，通过0.45μηι滤膜过滤备用。
[0027](2)蛋白酶Κ:取蛋白酶Κ粉剂50mg，加5ml水溶解，终浓度为10mg/ml，-20°C备用。
[0028]3.黄鳝基因组提取。
[0029](1)取1克黄鳝肌肉组织，SNET 500微升，蛋白酶K10微升，55度消化过夜。
[0030](2) 12000r，5分钟离心，取上清。
[0031 ] (3)加入等体积的酚氯仿，用力混匀，12000r 10分钟离心后去上清。
[0032](4)重复上述步骤3。
[0033](5)加入两倍体积的无水乙醇，沉淀10分钟以上。
[0034](6) 12000r 10 分钟，离心。
[0035](7 )用70%的乙醇洗涤一次，离心去上清。
[0036](8)自然晾干，加100微升水溶解。
[0037]4.PCR 扩增
利用以下引物进行PCR扩增(从5端到3端):
5，ATGAAAACGCACAGTGAGAT 3，
5，TTAAAGCTTAAGCTCTTTAA 3'
PCR程序为:94度5分钟，94度30秒，58度30秒，72度1分钟，循环数40个，72度5分钟，20度1秒。
[0038]5.利用1%的琼脂糖凝胶电泳跑胶检测。
[0039]【实施例2】黄鳝肉质与其他食用鱼肉质鉴别
动物:泥鳅、草鱼、鲤鱼、鲫鱼、鲢鱼、羊肉、猪肉、牛肉、鸡肉、黄鳝。
[0040]试剂:SNET(PH8.0)，蛋白酶K(10mg/ml)，酚氯仿，无水乙醇
实验方法:(1)取1克待检测物种的肌肉组织，SNET 500微升，蛋白酶K10微升，55度消化过夜。
[0041 ] (2)12000r，5分钟离心，取上清。
[0042](3)加入等体积的酚氯仿，用力混匀，12000r 10分钟离心后去上清。
[0043](4)重复上述步骤(3)。
[0044](5)加入两倍体积的无水乙醇，沉淀10分钟以上。
[0045](6)12000r 10 分钟，离心。
[0046 ] (7)用70%的乙醇洗涤一次，离心去上清。
[0047](8)自然晾干，加100微升水溶解。
[0048](9)以步骤8的样品作为模板，以本发明中所述引物进行扩增。
[0049](10)电泳检测。
[0050]实验结果:只有黄鳝样本制样所得样品可以得到大小准确的信号带(图2)。
【主权项】
1.一种鉴定黄鳝物种的PCR试剂盒，其特征在于，包括引物组、dNTP、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶和水，所述的引物组由引物1、引物2组成，可在Seq N0.1基因任意位置设计引物1和2，扩增所得PCR产物在其他物种中不存在。2.根据权利要求1所述的鉴定黄鳝物种的PCR试剂盒，其特征在于，引物1的序列如SeqN0.2所示，引物2的序列如Seq N0.3所示。3.权利要求1或2任一项所述的鉴定黄鳝物种的PCR试剂盒在鉴定黄鳝物种或鉴别黄鳝肉质与其他食用鱼肉质中的应用。4.一种鉴定黄鳝物种或鉴别黄鳝肉质与其他食用鱼肉质的方法，其特征在于，检测待测对象的基因组DNA，若基因组DNA中含有目的DNA分子，则所述待测对象为黄鳝;所述目的DNA分子为Seq N0.1，外显子个数为1个，位置是chr5: 28889163-28889999。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测待测对象的基因组DNA的方法为测序、PCR或分子杂交。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，用权利要求2PCR试剂盒中的引物1和引物2对待测对象的样品组织的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测PCR扩增产物，若PCR扩增产物具有837bp大小的扩增产物，则待测对象为黄鳝物种或肉质为黄鳝肉质;若PCR扩增产物不具有837bp大小的扩增产物，则待测对象不为黄鳝物种或肉质不为黄鳝肉质。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的退火温度具体为55-65°C。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增的退火温度具体为58°C。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测PCR扩增产物的方法具体为测序或电泳。10.根据权利要求4-9任一项所述的方法，其特征在于，待测对象的基因组DNA来源于离体的待测对象的组织器官或血液。
【专利摘要】本发明提供了一个黄鳝特有基因以及利用该基因鉴别黄鳝物种的方法。通过对黄鳝全基因组的深度测序发现了一个黄鳝物种特异的基因（EEL000313.2）。基于该基因序列信息设计引物，通过DNA提取、PCR扩增和凝胶电泳步骤可特异性扩增该基因（EEL000313.2）。本发明可以实现经济、快速且高效的鉴别黄鳝物种，有助于黄鳝的科研和培育，规范黄鳝肉类销售市场。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105483258
【申请号】CN201610002447
【发明人】周荣家, 程祎斌, 肖遥, 程汉华
【申请人】武汉大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月6日